Caryotype est une technique simple et utile largement utilisé pour détecter les altérations génétiques. Nous décrivons ici une étape par étape pour la préparation du protocole propagation de chromosomes de cellules souches embryonnaires humaines pour la surveillance du statut chromosomique de ces cellules maintenues en culture.
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Article de méthode
Préparation Étaler chromosomique des cellules souches embryonnaires humaines pour le caryotype
Dans cet article
Résumé
Résumé
Bien cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont été montrés à présenter un caryotype diploïde stables 1, de nombreuses études ont rapporté que, selon les conditions de culture, ils deviennent sujets à acquérir des anomalies chromosomiques telles que l'addition de tout ou parties de chromosomes. En effet, durant culture à long terme, les altérations chromosomiques sont observées lors de dissociation enzymatique ou chimique sont utilisés 2,3,4, tandis que la dissection manuelle des colonies pour repiquage conserve un caryotype stables 5. Par ailleurs, des changements dans l'environnement telles que la suppression de cellules nourricières semblent également compromettre l'intégrité génétique des CSEh 3,6. Une fois altérations chromosomiques peuvent affecter la physiologie cellulaire, la caractérisation de l'intégrité génétique des CSEh in vitro est cruciale CSEh considérant comme un outil essentiel dans les études de l'embryogenèse et de dépistage des drogues. Par ailleurs, pour l'avenir à des fins thérapeutiques modifications chromosomiques sont une réelle préoccupation car elle est souvent associée à la cancérogenèse.
Ici, nous montrons une méthode simple et utile pour obtenir une haute qualité pour les étalements de chromosomes analyse subséquente du chromosome fixé par G-banding, FISH, le ciel ou les techniques de CGH 7,8. Nous vous recommandons de vérifier le statut chromosomique régulièrement avec des intervalles de 5 passages afin de surveiller l'apparition de translocations et aneuploïdies
Priscila Britto et Rafaela Sartore contribué de façon égale sur le papier.
Protocole
EQUIPEMENT
- Culture tissulaire incubateur, 37 ° C, 5% de CO 2
- Centrifugeuse
- Jeu de micropipettes (100, 100 ul)
- 37 ° C Bain-marie
- Bain-marie 90 ° C pour être source de vapeur d'eau
- Microscope à contraste de phase
PREMIÈRE ÉTAPE
Traitant les cellules avec colcémide
Dans cette procédure, nous avons utilisé la ligne H9 de CSEh cultivés sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) inactivé à la mitomycine C (Sigma) et maintenu en DMEM/F12 (Invitrogen) complémenté avec de remplacement KO 20% de sérum (KSR, G....
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Discussion
La préparation des étalements de chromosomes est une étape critique pour une analyse réussie de l'état génétique des cellules souches embryonnaires par des techniques couramment comme le G-banding et des techniques plus sophistiquées telles que le poisson, SKY et CGH.
Cette procédure peut être appliquée pour de nombreux types cellulaires en faisant varier la période d'incubation colcémide, qui dépend de la longueur du cycle cellulaire. Pour des colonies de cellules souches embryonnai.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tube de centrifugation de 15 ml | Techno Plastic Products | 91015 | |
| Colcemid Karyo MAX | GIBCO, par Life Technologies | 15212-012 | |
| EDTA | Isofar | 721 | |
| Acide acétique glacial | Isofar | 100 | |
| Méthanol | Isofar | 208 | |
| Chlorure de potassium (KCl) | Merck & Co., Inc. | 104.931.000 | |
| Lame | Bioslide | 7105-1 | |
| Tripsine | Sigma-Aldrich | T4799 |
Références
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).
- Draper, J. S. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).
- M....
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Réimpressions et autorisations
