Explants av de centrala delarna av råtta lins epitel skilja synkront vid odling i närvaro av FGF-2. Immunofluorescens mikroskopi av sådana kulturer kan ger romanen information om genuttryck och signalering händelser i samband med terminal differentiering.
Den främre yta okularlinsen är täckt av ett monolager av epitelceller, som förökar sig i en ringformad zon som ligger bakom ciliarkroppen. Efter division, dessa celler vandrar posteriort, där FGF sprids från näthinnan inducerar dem att differentieras till en bakre rad långsträckta celler lins fiber, som utgör den största delen av linsen. Differentiering av objektiv epitelceller i linsen fibrer kan induceras in vitro genom odling explants av de centrala delarna av den främre epitelet i närvaro av FGF-2. Explants framställs av linser av neonatala råttor genom att ta bort linsen från ögat och ta tag i linskapseln på den bakre sidan med dissekera pincett. Den bakre kapsel är sedan försiktigt slits öppna och trycks ner i plast botten av en vävnadskultur maträtt. Det perifera regioner Explantation tas bort med skalpell och det centrala området är sedan odlade i närvaro av 100ng/ml FGF-2 så länge som 2-3 veckor, beroende på de parametrar som skall studeras. Eftersom epitelceller i odlade explants skilja i ungefärlig synkront över en period av dagar till veckor, kan den tid under signalering och genuttryck bestämmas med hjälp av molekylära, biokemiska och farmakologiska tekniker. Immunofluorescensmikroskopi är ett kraftfullt komplement till dessa metoder eftersom det visar att subcellulära lokalisering av proteiner av intresse och kan avslöja de fysiologiska effekterna av experimentella manipulationer av signalvägar.
Råttan Objektivet Explantation Systemet har framgångsrikt använts av ett antal laboratorier för att studera terminal differentiering av lins epitelceller att linsen fibrer 21,3,4,5. När de utsätts för FGF-2 på 100ng/ml i explants kommer att börja visa förändringar i signalering inom några minuter 6, med förändringar i morfologi och genuttryck visas sekventiellt under flera dagar 3,4,5. De kulturer förblir livskraftiga i 2-3 veckor om försiktighet vidtas för att förhindra kontaminering.
Den centrala explants som beskrivs i detta protokoll är särskilt användbara för att studera händelseförloppet i samband med differentiering, eftersom de innehåller få om ens några celler som uttrycker differentiering markörer innan FGF-2 läggs 1,5. Cellerna skilja sedan synkront, som en kohort, vilket gör det möjligt att följa tidsförloppet för signalering och transkriptionell händelser i samband med differentiering. Odling explants för olika lång tid ger således korrekt tidsmässig information om sekvensen händelser. Specifika hämmare kan läggas till odlingsmediet att identifiera relevanta signalvägar. Explants kan användas för att analysera proteinuttryck av SDS gelelektrofores och immunoblotting eller analysera uttrycket av specifika mRNA genom RT-PCR. Protein ger intervallet 20 till 50 mikrogram / Explantation och RNA avkastning är cirka 200 – 600 ng / Explantation, beroende på längden av kulturen period. Vi finner i allmänhet att 5-6 explants per fat kommer att ge tillräckligt med protein eller RNA för flera analyser. RNA från explants kan också användas för att förbereda cDNA för bedömning av genuttryck med microarray analys, som kan identifiera nya gener som kan vara avgörande för differentiering. Explants kan också transfekterades. Även transfektion effektivitet är generellt låga, är det tillräckligt för testmetoder reporter gener 4, 7, 8. Immunofluorescensmikroskopi av explants ger ett bra komplement till biokemiska metoder genom att bestämma subcellulära lokalisering av proteiner av intresse. Således ger förberedelse och kultur explants råtta objektivet ett kraftfullt system för att studera differentiering terminal lins hos däggdjur, vilket kan komplettera in vivo tekniker, såsom generering av transgena och knock-out möss.
Beredningen av lins epitel explants är en anpassning av metoder som har sitt ursprung i laboratoriet av Dr John McAvoy 9. Detta arbete finansieras av National Eye Institute, Interna Research Program Z01-EY000238-22