Подготовка Объединенные тромбоцитов человека лизат (pHPL) как эффективное дополнение для животных бессывороточной человеческих культур стволовых клеток
Summary
Человек тромбоцитов лизат является богатым источником факторов роста и мощным дополнением в клеточной культуре. Этот протокол представляет процесс подготовки большого пула тромбоцитов человека лизат, исходя из богатой тромбоцитами плазмы, выполняя несколько циклов замораживания-оттаивания и истощению тромбоцитов фрагментов.
Abstract
Тромбоцитарный факторов роста, как было показано, чтобы стимулировать пролиферацию клеток эффективно<em> В естественных условиях</em<sup> 1,2</sup> И<em> В пробирке</em>. Этот эффект проявляется в отношении мезенхимальные стромальные клетки (МСК), фибробласты и эндотелиальные колониеобразующих клеток тромбоциты активируются тромбином<sup> 3-5</sup> Или лизируются циклов замораживания / оттаивания<sup> 6-14</sup> Перед тромбоцитов releasate добавляется в питательную среду клетки. Трофические влияния тромбоцитарный факторы роста уже была опробована в нескольких испытаний для тканевой инженерии и регенеративной терапии.<sup> 1,15-17</sup> Изменение эффективности считается крайней мере, частично из-за индивидуально расходящихся концентрации факторов роста<sup> 18,19</sup> И отсутствие в настоящее время стандартизированные протоколы для тромбоцитов подготовки.<sup> 15,16</sup> Этот протокол представляет практически процедуры для создания пула тромбоцитов человека лизат (pHPL), полученных из регулярно производятся богатой тромбоцитами плазмы (PRP) от сорока до пятидесяти одной донорской крови. В нескольких циклов замораживания / оттаивания тромбоцитов оболочки повреждены и факторов роста эффективно выпущены в плазме. Наконец, тромбоцитов фрагменты удаляются с помощью центрифугирования, чтобы избежать обширного образования агрегатов и истощать потенциальных антигенов. Реализация pHPL в стандартные протоколы культура представляет перспективный инструмент для дальнейшего развития клеточной терапии распространяются в животный белок без системы.
Protocol
Discussion
В некоторых регионах богатой тромбоцитами плазмы (PRP) могут быть получены из Баффи пальто иначе быть отходы упакованных красных кровяных телец из протестированных доноров крови (рис. 1). Оптимально, PRP используется непосредственно для дальнейшей подготовки pHPL, как в устаревших концентр?…
Acknowledgements
Эта работа была поддержана австрийским исследовательского фонда (FWF, грант N211-NAN для DS) и Австрийское агентство по продвижению научных исследований (FFG, грант N200 для DS). Авторы выражают благодарность Клаудиа Url за отличную техническую помощь и Моника Фаррелл языковых редактирования.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Double bag (2 x 3.5L) | MacoPharma | VDL 8000XQ | originally for ascites puncture | |
| 50 mL Falcon tube | Falcon BD | 2098 | ||
| 50 mL Stripettes | Costar | 4501 | ||
| Plasma bags (600mL) | Baxter | R4R2021 | ||
| Sterile tubing welder | Terumo | TSCD-II | ||
| Welding equipment | Fresenius Kabi | Compo Seal | ||
| Water bath | ||||
| Sterile scissors | ||||
| Clamps | ||||
| Centrifuge |
References
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. Platelets and wound healing. Front Biosci. 13, 3532-3548 (2008).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound Repair Regen. 16, 585-601 (2008).
- Giacco, F. Thrombin-activated platelets induce proliferation of human skin fibroblasts by stimulating autocrine production of insulin-like growth factor-1. FASEB J. 20, 2402-2404 (2006).
- Kocaoemer, A., Kern, S., Kluter, H., Bieback, K. Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue. Stem Cells. 25, 1270-1278 (2007).
- Kakudo, N. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plast Reconstr Surg. 122, 1352-1360 (2008).
- Doucet, C. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: A safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J Cell Physiol. 205, 228-236 (2005).
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum Tissue Eng Part. C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Lange, C. Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine. J Cell Physiol. 213, 18-26 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Bernardo, M. E. Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches: further insights in the search for a fetal calf serum substitute. J Cell Physiol. 211, 121-130 (2007).
- Carrancio, S. Optimization of mesenchymal stem cell expansion procedures by cell separation and culture conditions modification. Exp Hematol. 36, 1014-1021 (2008).
- Muller, A. M. Platelet lysate as a serum substitute for 2D static and 3D perfusion culture of stromal vascular fraction cells from human adipose tissue. Tissue Eng Part A. 15, 869-875 (2009).
- Anitua, E., Sanchez, M., Orive, G., Andia, I. The potential impact of the preparation rich in growth factors (PRGF) in different medical fields. Biomaterials. 28, 4551-4560 (2007).
- Anitua, E. New insights into and novel applications for platelet-rich fibrin therapies. Trends Biotechnol. 24, 227-234 (2006).
- Martinez-Zapata, M. J. Efficacy and safety of the use of autologous plasma rich in platelets for tissue regeneration: a systematic review. Transfusion. 49, 44-56 (2009).
- Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J Craniomaxillofac Surg. 30, 97-102 (2002).
- Frechette, J. P., Martineau, I. &. a. m. p. ;. a. m. p., Gagnon, G. Platelet-rich plasmas: growth factor content and roles in wound healing. J Dent Res. 84, 434-439 (2005).
- Seghatchian, J., Krailadsiri, P. The platelet storage lesion. Transfus Med Rev. 11, 130-144 (1997).
- Selvaggi, T. A., Walker, R. E., Fleisher, T. A. Development of antibodies to fetal calf serum with arthus-like reactions in human immunodeficiency virus-infected patients given syngeneic lymphocyte infusions. Blood. 89, 776-779 (1997).
- Tonti, G. A., Mannello, F. From bone marrow to therapeutic applications: different behaviour and genetic/epigenetic stability during mesenchymal stem cell expansion in autologous and foetal bovine sera. Int J Dev Biol. 52, 1023-1032 (2008).
- Bieback, K. Human Alternatives to Fetal Bovine Serum for the Expansion of Mesenchymal Stromal Cells from Bone Marrow. Stem Cells. , (2009).
- Rohde, E., Schallmoser, K., Bartmann, C., Reinisch, A., Gad, S. C. GMP-Compliant Propagation of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Regulations and Quality. , 97-115 (2008).
