Visualiseren van Single-molecule DNA-replicatie met fluorescentiemicroscopie

Summary

Dit protocol laat een eenvoudige single-molecule fluorescentie microscopie technieken voor het visualiseren van DNA-replicatie door individuele replisomes in real time.

Abstract

Beschrijven we een eenvoudige fluorescentie microscopie op basis van real-time methode voor de waarneming DNA-replicatie op de single-molecule-niveau. Een ronde, gevorkte DNA-template is bevestigd aan een gefunctionaliseerd glazen dekglaasje en uitvoerig gerepliceerd na de introductie van replicatie eiwitten en nucleotiden (figuur 1). De groeiende product dubbel-strengs DNA (dsDNA) is uitgebreid met laminaire flow en gevisualiseerd met behulp van een intercalerende kleurstof. Het meten van de positie van de groeiende DNA-einde in real-time zorgt voor een precieze bepaling van de replicatie-tarief (figuur 2). Bovendien is de lengte van de voltooide DNA-producten rapporten over de processivity van replicatie. Dit experiment kan heel gemakkelijk en snel worden uitgevoerd en vereist slechts een fluorescentie microscoop met een redelijk gevoelige camera.

Protocol

Voor het uitvoeren van een single-molecule replicatie experiment, een aantal materialen moeten worden voorbereid op voorhand. 1. DNA-replicatie Template Het substraat voor de replicatie reactie is een gebiotinyleerd, staart M13 rolling circle bereid met behulp van standaard moleculair-biologische technieken 1,2. Materialen: M13mp18 enkelstrengs DNA, Biotinylated staart oligonucleotide primer (5'-biotine-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 '), T7 DNA-polymerase, Heat blokkeren, fenol / isoamylalcohol / Chloroform Gloeien de gebiotinyleerde staart oligo aan de M13 door het toevoegen van een 10-voudige overmaat van oligo in TBS-buffer (330 nM staart oligo, 33 nM M13). Verwarm het mengsel tot 65 ° C in de hitte te blokkeren. Eenmaal verwarmd, zet het vuur blok uit en laat langzaam afkoelen tot goed gloeien de primer. Voeg de gegronde M13 aan een mengsel van 64 nM T7 DNA-polymerase en T7 replicatie buffer met dNTPs en MgCl 2. Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 12 minuten en blussen met 100 mM EDTA. Zuiveren de ingevulde product DNA met fenol / chloroform / isoamylalcohol extractie-en dialyze in TE-buffer of een ander geschikt opslagbuffer en bepaal DNA-concentratie (Back-extract elke organische fase om eventuele resten van primer M13 terug te krijgen). Een herhaling van de sjabloon voorbereiding kan gemakkelijk enkele milliliters nanomolaire concentratie sjabloon, genoeg voor honderden tot duizenden single-molecule experimenten. 2. Gefunctionaliseerde Dekglaasjes Voor het bevestigen van het DNA aan het glas dekglaasje, is het glas eerste gefunctionaliseerd met een aminosilaan, die vervolgens is gekoppeld aan gebiotinyleerd PEG-moleculen. Deze coating helpt om de niet-specifieke interacties tussen DNA en eiwitten replicatie te verminderen met het oppervlak 1,3. Materialen: Glas dekglaasjes, vlekken potten, 3-aminopropyltriethoxysilaan, Methoxy-PEG5k-NHS ester, biotine-PEG5k-NHSester, aceton, 1M KOH, Ethanol, Oven, Bad ultrasoonapparaat Het glas zorgvuldig schoonmaken dekglaasjes door ze in de kleuren van potten en het vullen van de potten met ethanol. Sonificeer 30 minuten en spoel uit de potten en vul aan met 1 M KOH. Sonificeer 30 minuten Herhaal beide wasbeurten. Voor de eerste functionalisering reactie, alle sporen van water moeten worden verwijderd. Vul de potten met aceton en ultrasone trillingen gedurende 10 minuten. Weer Spoel de potten met aceton. Bereid een 2% v / v oplossing van het silaan reagens in aceton. Toe te voegen aan de kleuring potten en schud gedurende 2 minuten. Deze reactie koppels de alkoxygroep van de aminosilaan aan het glas, waardoor een reactieve amine voor de volgende koppeling stap. Quench de reactie met een grote hoeveelheid water. Droog de dekglaasjes door het bakken ze op 110 ° C in de oven gedurende 30 minuten. Bereid een 50:1 methoxy: biotine PEG mengsel in 100 mM NaHCO 3 pH 8,2. Streven naar circa 0,2% w / v gebiotinyleerd PEG. Pipetteer 100 ul van de PEG mengsel op een droge gesilaniseerd dekglaasje aan en plaats nog een dekglaasje bovenop. Inclusief een glazen dekglaasje spacer zal scheiden van de dekglaasjes. Incubeer de dekglaasjes in de PEG-oplossing gedurende 3 uur, dan scheidt je elk paar van dekglaasjes en was uitgebreid met water. Wees voorzichtig om de dekglaasjes gefunctionaliseerde kant naar boven als slechts een keer zijde zal worden bekleed met PEG. Droog de dekglaasjes en op te slaan onder vacuüm. Het oppervlak blijft stabiel gedurende tenminste een maand, zodat tientallen dekglaasjes kunnen worden gemaakt in een batch en gebruikt als dat nodig is. Deze materialen moeten van tevoren worden gemaakt en vervolgens gebruikt voor elk experiment. Om te beginnen elke single-molecule experiment, beginnen met het monteren van de stroom kamer. 3. Flow Kamer Voorbereiding Het experiment is uitgevoerd met behulp van een eenvoudige stroom kamer gebouwd met een gefunctionaliseerde dekglaasje, dubbelzijdige tape, een glijbaan en kwarts buizen. Een stroom kamer is bereid voor elke single-molecule experiment 1,4. Materiaal: Dubbelzijdig tape, scheermesjes, Quartz glijbaan met gaten voor slangen, Quick-droge epoxy, Gefunctionaliseerde dekglaasje (zie boven), Streptavidine oplossing (25 il van 1 mg / ml in PBS), Tubing, blokkeren buffer (20 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2 mg / ml BSA, 0,005% Tween-20) Begin met het plaatsen van 20-25 ml van het blokkeren van buffer in een exsiccator tot eventuele luchtbellen te verwijderen om later te stappen. Neem een ​​PEG-gefunctionaliseerde dekglaasje en de verspreiding van 125 PBS-verdunde streptavidine-oplossing over het oppervlak. Laat dit incubeer gedurende 20 minuten tijdens de voorbereiding van andere delen van de kamer, waardoor streptavidine aan de oppervlakte biotins te binden. Knip een stuk van de double-sided tape om de grootte van de kwarts slide wedstrijd. Markeer de positie van de buis gaten in de tape met een potlood, zodat een overzicht van de stroom kamer kan worden getrokken op de band (1 mg / ml). Maak een 2 mm brede rechthoek rond de gaten. Dit zal dienen als de stroom kanaal, dus zorg ervoor dat rechte zijden te maken en ruimte te laten om de buizen in-en uitlaat. Indien gewenst, kunnen meerdere kanalen of verschillende formaten worden gebruikt. Knip langs de getekende omtrek, het maken van rechte, schoon snijdt dat er geen lijm steekt te maken in het kanaal. Reinig de kwarts grondig met aceton of ethanol om lijm te verwijderen van de vorige stroom cel constructie. Vind de beste uitlijning van het kanaal omtrek, verwijder de ene kant van de zelfklevende achterzijde en de zorgvuldig de tape plaats op de kwarts dia. Wees voorzichtig om de tape goed af te stemmen, omdat de inlaat en uitlaat gaten moeten blijven gedeblokkeerd. Lengte gesneden van buizen voor de inlaat en uitlaat van de stroom cel. Het helpt om het einde van de buis gesneden op ongeveer een hoek van 30 °, zodat de buis zal niet plat drukken tegen de kamer bodem. Plaats de buizen op een soort van steun aan hen te schorsen voor eenvoudige bevestiging aan de stroom cel in de volgende stappen. Spoel de streptavidine-gecoate dekglaasje met water en droog met perslucht. Vergeet niet dat maar een kant is gefunctionaliseerd, pas dan op dat het dekglaasje draaien. Verwijder de andere zijde van de cassette en plaats de steun kwarts schuif op het dekglaasje. Druk lichtjes op het dekglaasje te duwen uit alle lucht in de lijm. Dit zal helpen voorkomen dat eventuele luchtbellen krijgen in de stroom-kanaal. Sluit de zijkanten van de kamer met epoxy. Steek de gesneden slang in de gaten van de kwarts en afdichting op zijn plaats met epoxy. Dit moet drogen voor een paar minuten. Eenmaal droog, beginnen te blokkeren het oppervlak door te trekken sommige van de ontgast blokkerende buffer via een van de buizen. Een 21-gauge naald past perfect in de 0,76 mm slang. Spoel een paar keer om luchtbellen te verwijderen, en laat de kamer om te incuberen gedurende minstens een half uur. 4. Single-molecule replicatie Experiment Materialen: Bereid stroom kamer, SYTOX Orange, TIRF microscoop, 532 nm laser-, CCD-camera, Computer met beeldacquisitie software, Rolling-cirkel DNA substraat, replicatie eiwitten Na de stroom cel is geblokkeerd, alles is klaar om de single-molecule experiment te beginnen. Neem de stroom cel en plaats het op de microscoop podium. Houd de kamer op zijn plaats met podium clips en zorg ervoor dat de stroom kanaal is geplaatst rechtdoor langs de y-as. Sluit de stroom cel uitlaatbuis aan de spuit pomp met behulp van een grotere diameter connector buis of een naald. Plaats de inlaat in de blokkeerbuffer en trekt terug op de spuit om eventuele lucht te verwijderen in de buis. Een zachte tik van de afvoerbuis zal helpen duidelijke eventuele luchtbellen gevangen in de stroom cel. Verdun de voorraad DNA-template tot 25 pM in 1 ml van het blokkeren van buffer. Stroom in de kamer bij matige debiet een goede oppervlakte-dekking van DNA mogelijk te maken. 0.025 ml / min gedurende 30 minuten werkt goed. Dit kan worden gevarieerd op basis van het aantal DNA-moleculen op het oppervlak van elke partij dekglaasjes of hoeveel gewenst zijn voor het experiment. Eenmaal DNA is in, was het overtollige DNA met behulp van het blokkeren van buffer. Was voor minstens 200 flow-cell volumes om zich te ontdoen van alle gratis DNA. Begin ontgassen van de replicatie buffer. Voor de E. coli replicatie experimenten, doe dit bij 37 ° C om het risico van bubbels in het verwarmde kamer stroom te verminderen. Zet de laser en de camera. Het afgekoelde CCD dient om de temperatuur te bereiken voordat het kan worden gebruikt. Als het uitvoeren van een 37 ° C experiment, zet de verwarming aan. Zorg ervoor dat het doel is in contact met de stroom cel of het zal een koellichaam later. Na het wassen en ontgassen, kan de reactie worden voorbereid. Mix nucleotiden, DTT, en SYTOX in de replicatie buffer. Voeg vervolgens eiwitten en meng voorzichtig. Doorstroming van het reactiemengsel in de stroom cel. Deze stroom snelheid moet voldoende zijn om dsDNA rekken. Voor een 2-mm breed, 100-um hoge stromingskanaal 0,04 ml / min werkt goed. Wacht tot het mengsel naar de kamer gaan en beginnen met beeldvorming. Een goede tip is om het gezichtsveld te verplaatsen naar de kant van het kanaal en op het kleefmiddel focus. Dit zal ervoor zorgen dat u dicht bij de oppervlakte voor het scherpstellen. Pas laservermogen, microscoop focus, en TIRF hoek. Houd de batterij bijna leeg op een photocleavage van de gekleurde DNA te vermijden. Te verwerven op 1-5 frames / seconde gedurende enkele minuten, afhankelijk van de snelheid van de DNA-replicatie. Indien gewenst, herhaal je bij langere trajecten replicatie te krijgen of om een ​​nieuw veld te verplaatsen naar meer moleculen te zien. Nadat het reactiemengsel is bijna leeg, het is een goed idee om meer doorstroming in buffer met SYTOX tot andere gebieden van te bekijken. Het nemen van meerdere beelden van verschillende gerepliceerd moleculen biedt statistieken voor processivity bepalen. 5. Representatieve resultaten Actief replicerende moleculen zijn gemakkelijk gezien als groeiende lijnen van lood DNA. In onze experimenten, vloeiende 25 pM van de M13 substraat geeft 100-1000 moleculen in een 60x, 125 x 125 um um gezichtsveld (figuur 1). Het uitvoeren van replicatie experimenten met de E. coli replisome eiwitten bij 37 ° C (zie Materialen voor details) geeft 50 tot 50 replicerende moleculen per gezichtsveld. Bij equivalente concentraties van de T7 replisome, die initieert op de ondergrond veel efficiënter, zien we> 70% van de moleculen in een veld te bootsen. Deze voorwaarden leveren een product dichtheid zo hoog, dat de individuele moleculen zijn moeilijk op te lossen en te analyseren, zodat de T7 experimenten worden uitgevoerd bij lagere eiwit concentraties. Data-analyse: Voor het verkrijgen van data rate, eenvoudig plot het eindpunt van de DNA versus tijd en bereken de helling (figuur 2). Voor processivity, bepalen van de totale lengte van het DNA. Beide nummers zullen moeten worden omgezet naar basenparen. Voor het uitvoeren van het experiment, moet u weten de pixel formaat van de camera op de juiste vergroting. Voor de basenparen conversie, is een goede inschatting gewoon omzetten op basis van de kristallografische lengte van de DNA, 2,9 bp / nm. Echter, laminaire stroming niet volledig de DNA-stretch, dus een DNA-lengte kalibratie moet worden uitgevoerd door het nemen van een bekende lengte DNA, bijvoorbeeld 48.502 bp λ DNA, het bevestigen van het aan de stroom cel met een gebiotinyleerd oligo en het meten van de SYTOX-gekleurde lengte bij het debiet wordt gebruikt voor replicatie experiment. Bepalen van het aantal basenparen / pixel zal maken een nauwkeurige berekening van de tarieven en replicatie processivities. Het nemen van tal van foto's en films zullen een groot aantal product-molecuul, waardoor het plotten van de snelheid en processivity distributies (figuur 2) 1. Figuur 1: (Van Ref 1.) A) Cartoon van de uitrol cirkel replicatie assay. (SA, streptavidine). Toonaangevende-streng synthese van een uitbreiding van de staart tussen de cirkel en de oppervlakte. De staart wordt omgezet in dsDNA door de achterblijvende streng polymerase en uitgerekt door de laminaire stroming. b) Voorbeeld gebied van beeld met SYTOX Orange en 532 nm excitatie. Kleine fluorescerende vlekken worden vastgebonden, niet-gerepliceerde substraten. Let op de extreme lengte van de producten en het grote aantal producten per veld (elke flow cel bevat> 5000 dergelijke velden). Figuur 2: (aangepast vanaf Ref 1.) A, b) Kymographs van typische replicerende moleculen uit T7 (a) en E. coli (b) experimenten. c) Eindpunt trajecten van moleculen uit a) en b) uitgezet tegen de tijd. Trajecten zijn voorzien van een lineaire regressie om de replicatie tarieven te verkrijgen. Getoonde voorbeelden zijn 99,4 bp s -1 en 467,1 bp s -1. d) Lengte verdelingen van replicatie producten passen bij een exponentiële verval naar processivity verkrijgen: 25,3 ± 1,7 kbp (T7), 85,3 ± 6,1 kbp (E. coli). e) Rate verdelingen van single molecule trajecten, fit met enkele gaussianen. Betekent: 75,9 ± 4,8 bp s -1 (T7), 535.5 ± 39 bp s -1 (E. coli).

Discussion

Een kritische controlepunten onderzoekt het effect van de vlek, SYTOX Oranje, op de replicatie eiwitten van belang. Een eenvoudige manier om dit te doen is het uitvoeren van de replicatie experiment in de stroom cel, zoals beschreven, maar met weglating van SYTOX. Nadat het reactiemengsel heeft stroomde door de kamer, voeg buffer met SYTOX om DNA vlek en de lengte verdeling van gerepliceerde moleculen te onderzoeken. Als alternatief kan standaard bulk reacties worden gebruikt om een ​​effect van SYTOX op de replicatie snelheid en efficiency te controleren.

De hier beschreven experiment maakt gebruik van slechts een enkele stroom kanaal. Dit kan eenvoudig worden veranderd door het creëren van multi-channel stromingskamers of met behulp van PDMS of soortgelijke microfluïdische apparaten. Toename van het aantal kanalen sterk vergemakkelijkt screening van eiwitconcentraties, mutanten, of remmer moleculen en verhoogt de snelheid van replicatie van gegevens verzamelen.

Zoals gezegd, voeren we de E. coli replicatie experimenten bij 37 ° C met behulp van een zelfgebouwde aluminium flow cel verwarming, een resistief verwarmingselement (verwarmingspatroon) en variabele voeding. Dit geeft een goede temperatuur stabiliteit en voorkomt de aanschaf van een objectieve verwarming. Te kalibreren de verwarming, we gewoon geboord een gat in het midden van een kwarts flow cel top, ingevoegd een thermokoppel in het stromingskanaal en stroomde buffer als normaal. Het meten van de stroom cel buffer temperatuur op het verhogen van voltages maakt nauwkeurige verwarming.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
M13mp18 ssDNA		New England Biolabs	N4040
Biotinylated Tail Oligo		Integrated DNA Technologies
T7 DNA Polymerase		New England Biolabs	M0274	Use T7 replication buffer for substrate preparation
Phenol/ Isoamyl Alcohol/ Chloroform		Roche	03117987001	24:24:1 v/v
3-aminopropyl-triethoxysilane		Sigma	A3648	Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG		Nektar		Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS		Nektar
Double-sided tape		Grace BioLabs	SA-S-1L	100 μm thickness
Quartz slide		Technical Glass	20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)	Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing		Becton Dickinson	427416	0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted.
Streptavidin		Sigma	S4762	Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix		New England Biolabs	N0447
Ribonucleotide triphosphate solutions		Amersham	272056 272066 272076 272086
SYTOX Orange		Invitrogen	S11368	Other dsDNA stain can be used
Fluorescence Microscope with 60x TIRF objective		Olympus	IX-71	Microscope, camera, etc. can be substituted for similar equipment
Syringe Pump		Harvard Apparatus	11 Plus	Operate in refill mode to facilitate solution changes
532 nm laser		Coherent	Compass 215M-75	Select wavelength to correspond to stain of choice
EMCCD Camera		Hamamatsu	ImagEM
Emission filter		Chroma	HQ600/75m

T7 Replication: 40 mM Tris pH 7.5, 50 mM potassium glutamate, 10 mM magnesium chloride, 100 μg/mL BSA, with 5 mM dithiothreitol, 600 μM dNTPs, 300 μM ATP, 300 μM CTP, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 5 nM gp4 (hexamer), 40 nM polymerase (1:1 gp5: thioredoxin), 360 nm gp2.5^1,5.

E. coli Replication: 50 mM HEPES pH 7.9, 12 mM magnesium acetate, 80 mM potassium chloride, 100 μg/mL BSA with 10 mM dithiothreitol, 40 μM dNTPs, 200 μM rNTPs, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ₂γ₁δδ’χψ or τ₃δδ’χψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT^1,6