Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Summary

Für viele wissenschaftliche Studien, die eine biologische und chemische Analyse von Zell-Populationen müssen die Zellen in einem hohen Zustand der Reinheit sein. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) ist eine überlegene Methode, bei der reinen Zellpopulationen zu erhalten.

Abstract

Experimentelle und klinische Studien erfordern oft hochreine Zellpopulationen. FACS ist eine Technik der Wahl, um Zellpopulationen bekannter Phänotyp zu reinigen. Andere bulk Methoden der Reinigung sind Panning, ergänzen Erschöpfung und Magnetic Bead Separation. Allerdings hat FACS mehrere Vorteile gegenüber anderen verfügbaren Methoden. FACS ist die bevorzugte Methode, wenn eine sehr hohe Reinheit des gewünschten Bevölkerung erforderlich ist, wenn die Zielzelle Bevölkerung ein sehr niedriges Niveau der Identifizierung Marker drückt oder wenn Zellpopulationen erfordern Trennung basierend auf differentiellen Marker Dichte. Darüber hinaus ist FACS die einzige verfügbare Reinigungsverfahren für Zellen auf innere Färbung oder intrazelluläre Protein-Expression basiert, wie eine gentechnisch veränderte fluoreszierendes Protein-Marker zu isolieren. FACS ermöglicht die Reinigung von einzelnen Zellen nach Größe, Granularität und Fluoreszenz. Um Zellen von Interesse zu reinigen, werden diese zunächst mit Fluoreszenz-markierten monoklonalen Antikörpern (mAb), die spezifische Oberfläche Marker auf die gewünschte Zellpopulation (1) zu erkennen gefärbt. Negative Auswahl von ungefärbten Zellen ist ebenfalls möglich. FACS Reinigung erfordert ein Durchflusszytometer mit Sortier-Kapazität und der entsprechenden Software. Für FACS werden Zellen in Suspension als Stream in Tröpfchen mit jeweils einer einzelnen Zelle vor einer Laser hindurchgeführt. Die Fluoreszenz-Detektionssystem erkennt Zellen von Interesse auf vorbestimmten fluoreszierenden Parameter der Zellen. Das Gerät gilt eine Gebühr, die Tröpfchen mit einer Zelle von Interesse und eine elektrostatische Ablenkung erleichtert Sammlung der geladenen Tröpfchen in entsprechende Sammelröhrchen (2). Der Erfolg der Färbung und damit Sortierung hängt weitgehend von der Auswahl der Identifizierung von Markern und die Wahl der mAb. Sortieren Parameter können je nach Anforderung der Reinheit und Ausbeute werden. Obwohl FACS erfordert spezielle Ausrüstung und Ausbildung des Personals, ist es die Methode der Wahl für die Isolierung von hochreiner Zellpopulationen.

Protocol

Vor Beginn des Prozesses, müssen die folgenden Punkte zu sein, gesammelt und aufbereitet: Eis 15 ml konische Röhrchen zum Färben von Zellen und 12 x 75 mm Strömungsrohre zur Färbung einfarbig steuert. Färbepuffer: Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) + 3% fötalem Kälberserum (FCS) Pipetten Fc-Block (falls erforderlich) und Färbung Antikörper. Antikörper müssen für eine optimale Färbung titriert werden. Compensation Perlen Suspensionspuffer: Hank Balanced Salt Solution (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS Trypanblau und Hämozytometer Zellsieb (40 um Nylon) Sammlung Röhren: Zwei Arten von Sammelröhrchen können a) 12 x 75 mm Polystyrol-Röhrchen (mit 300 ul FCS und 25 mM HEPES) oder b) 15 ml konische Röhrchen (mit 1 ml FCS + 25 mM HEPES) werden. Jeder reiche Medium mit hoher Konzentration im Serum kann für die Sammlung von sortierten Zellen verwendet werden. Generieren Sie eine einzelne Zelle Aussetzung der ab-Zell-Population. Optional: Bereichern Sie für die gewünschte Zellpopulation durch eine Bulk-Reinigungsverfahren wie Komplement Erschöpfung oder magnetische Sortierung. Der wesentliche Vorteil der Anreicherung Schritt ist, dass es die Art der Zeit reduziert. Wash Zellen einmal mit Färbepuffer. Überstand verwerfen und Zellen in Färbepuffer in einer Konzentration bis zu 50 x 10 6 zur effizienten Färbung. Optional: Für Zellen, die ein hohes Maß an FcR, blockieren die Rezeptoren mit einem geeigneten Blocking-Methode. Eine Methode der Wahl ist die Verwendung eines mAb, die auf Eis für 10-15 min FcyR bindet. Diese Antikörper sind kommerziell erhältlich. Fügen Sie die entsprechenden mAb (in einer vorbestimmten Konzentration) auf die gewünschte Zellpopulation Fleck und inkubieren für 20-30 min auf Eis im Dunkeln, durch zwei Waschungen mit Färbepuffer gefolgt. Optional: Die Färbung mit einem vitalen Farbstoff, wie Propidiumiodid kann enthalten, um tote Zellen (5) zu erkennen sein. Wenn Multi-Color-Färbung verwendet werden soll, sind einfarbig Kontrollen erforderlich. Wir verwenden BD CompBeads einzelne Farbe Kontrollen vorzubereiten mit dem Protokoll des Herstellers. Wenn nicht mit direkt konjugierten Antikörpern, wiederholen Sie Schritt 7 mit den entsprechenden Sekundär-Antikörper oder Streptavidin-Konjugat. Nach dem Waschen die Zellen in Kulturmedium und bestimmen die Zellkonzentration mit einem vitalen Farbstoff wie Trypanblau. Passen Sie die Zellkonzentration auf 15-20 x 10 6 / ml. Für Zellpopulationen, die Cluster bilden, die das Instrument bei der Sortierung können verstopfen, die Zellen-Filter durch ein Sieb. Einrichten und optimieren die Zell-Sorter. Der Prozess der Einrichtung eines Durchflusszytometer variiert in Abhängigkeit von der Herstellung und muss von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. Die allgemeinen Empfehlungen lauten wie folgt: Wählen Sie die gewünschte Düse je nach Zelltyp, die sortiert werden. Für sterile Sorten, sterilisieren das Instrument. Führen Instrument der Qualitätskontrolle mit Perlen, um zu überprüfen Laser funktionieren, und es ist genau sortieren. Installieren Sie die erforderlichen Auffangvorrichtung und richten Sie die Seite Streams. Schauen Sie sich das Instrument der Laser und Detektor bis zum fluoreszierenden Markierungen, die verwendet werden (unser BD FACS Aria hat drei Lasern und können bis zu neun Farben zu erkennen) kann bestimmen, festgelegt. Sobald festgestellt wird, was fluoreszierenden Markierungen auf der Zell-Sorter verwendet wird, kann Entschädigung durchgeführt werden (wie unten beschrieben) werden. Führen Ausgleich mit der negativen Kontrollprobe und die einzige positive Kontrollen. Kompensation ist notwendig, um das Spektrum Überschneidungen zwischen beiden Detektoren zu entfernen. Es muss darauf hingewiesen werden, dass eine Entschädigung nicht narrensicher und wird negativ durch, wie hell bestimmte Marker Fleck, und die Fluoreszenz der Zellen, die geringe Autofluoreszenz, die zu einer schlechten Auflösung zwischen dunkel und negativen Populationen führen kann betroffen sind. Für beste Ergebnisse sollte das experimentelle Design umfassen die Verwendung von hellen Fluorochrome mit Markern, die geringe Expression haben oder die nicht über ein bekanntes Fluoreszenzmuster. Marker, die eine gute Trennung zwischen Zellpopulationen und sind hoch exprimiert bieten sollte mit Dimer Fluorochrome wie diejenigen von roten oder violetten Laser angeregt werden. Eine Entschädigung kann mit Kompensation Perlen, die Polystyrol-Mikropartikel, die mit einem Antikörper spezifisch für die Kappa leichten Kette des Ig aus Maus, Ratte, Ratte oder / Hamster wurden gekoppelt sind, ausgeführt werden. Die Perlen sind leicht zu färben, haben ein robustes Signal und bieten eine einfache Möglichkeit zur Herstellung von einzelnen Flecken Steuerelemente, die die gleichen Fluorophor wie die experimentellen Proben. Richten Sie eine Vorlage, die eine bivariate Plan, forward scatter (FSC) und Seitwärts-Streulicht (SSC), und ein Histogramm zur Anzeige umfasstjedes Fluorochrom, die verwendet werden. Führen Sie die negative Kontrolle Röhre und stellen Sie die forward scatter (FSC) und Seitwärts-Streulicht (SSC), um die Bevölkerung von Interesse auf der Skala statt. Passen Sie die Fluoreszenz PMT-Einstellungen, um die negativen Bevölkerung oder Autofluoreszenz im äußersten linken Teil des Histogramms Platz. Notieren Sie sich die negative Kontrolle Röhre. Führen Sie das einzige positive Kontrolle Rohre und notieren Sie die Daten für jede Röhre. Zeichnen Sie ein Intervall Schutzzaun um den positiven Teil der Daten auf das Histogramm, und ein anderes Intervall Tor auf der negativen Teil des Histogramms. Manuelle Kompensation wird durch die Einstellung erfolgt der Median (Median ist eine bessere Schätzung der zentralen Tendenz als der Mittelwert auf einer logarithmischen Skala) des Positiven, bis er gleich dem Median der Negative ist. Dies muss für jeden der Fluorochrom-Etiketten in dem Experiment verwendete durchgeführt werden. Zur Einstellung der Median, passen Sie die spektrale Überlappung Werte höher oder niedriger, bis die Mediane für die einzelnen fluoreszierenden Parameter entsprechen so genau wie möglich. Eine Entschädigung kann auch automatisch mit Analyse-Software geschehen. Automatische Kompensation verwendet die erfassten Daten von der Entschädigung Kontrollen eine algebraische Matrix für alle Fluorophore in dem Experiment verwendete berechnen. Diese Werte werden verwendet, um zu subtrahieren aus den Beiträgen der nicht-primären Farben, die in einer Grundfarbe des Detektors Blutungen sind. Notieren Sie sich die experimentelle Probe, die sortiert werden und die Nutzung Gating-Tools und subsetting Methoden, um die Bevölkerung von Interesse zu definieren. Richten Sie die experimentelle Vorlage mit einem Punkt-Diagramm, dass FSC vs SSC-Displays und einen Gating-Werkzeug, Polygon, Rechteck-, Intervall-oder Quadranten zu Tor der Bevölkerung von Interesse. Das Streudiagramm zeigt die physikalischen Eigenschaften der Zelle, die verschiedene auf den jeweiligen Zelltyp ist. Der beste Weg, um die Fluoreszenz-Gating-Strategie zu bestimmen, ist die Fluoreszenz minus eins (FMO)-Steuerelemente verwenden. In einem FMO Steuerrohr alle Reagenzien, die in dem Experiment verwendet werden, sind mit Ausnahme des einen von Interesse enthalten. Die FMO hilft zu unterscheiden zwischen schwach gefärbte Populationen und breiten negativen Populationen. Verwenden Sie die Daten aus FMO Rohren aufgenommen, um festzustellen, wo man Tore in die Röhre statt. Nach Toren bestimmt worden sind, können die Tore für die Sortierung in externe Sammelröhrchen ausgewählt werden. Bis zu vier Toren (oder Populationen) kann zu einem Zeitpunkt in Abhängigkeit von der Instrumentierung zur Verfügung sortiert werden. Führen Sie die experimentelle Probe-Röhrchen bei 4 ° C, auf Ablenkplatten drehen und Art der Probe. 5 x 10 5 -1,5 x 10 6 Zellen in eine 12 x 75 mm Rohr und 1,5 sortiert x 10 6 bis 4,5 x 10 6 Zellen in eine 15 ml konische sortiert werden. Sobald die erforderliche Anzahl von Zellen erhalten worden ist, manuell stoppen Sortierung. Führen Sie eine post-Art-Analyse, um die Reinheit der sortierten Zellpopulationen zu ermitteln. Repräsentative Ergebnisse Wir haben hier für Maus Milz B-und CD4 T-Zell-Sortierung (Abbildung 1) gezeigt. Milzzellen wurden mit PE Texas Red-konjugiertem Anti-Maus-B220, FITC-konjugierten Anti-Maus-TCRβ und AlexaFluor-700-konjugierten Anti-Maus-CD4 an B-Zellen (B220 + TCRβ-) und CD4 T-Zellen (CD4 + + TCRβ identifizieren gebeizt ). Die Sortierung wurde mit BD FACS Aria Instrument durchgeführt. Nach dem Sortieren der B-Zell-Reinheit betrug> 97% und die CD4 T-Zell-Reinheit betrug> 98%. Abbildung 1. Die Reinheit der Milz B-Zellen und CD4 T-Zellen nach FACS. Maus Milzzellen mit anti-Maus-B220, TCRβ und CD4 Antikörper gefärbt wurden. FACS für B-Zellen wurde mit einem BD FACS Aria durch Gating auf B220 + TCRβ-Zellen (Abb. 1A, links, untere rechte Quadrant). Ein Beitrag Sortieren Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit der B-Zellen (Abb. 1A, rechts) zu bestimmen. B220-Färbung ist auf der x-Achse und TCRβ Flecken auf der y-Achse dargestellt. FACS für CD4 T-Zellen wurde unter Verwendung der gleichen Durchflusszytometer durch Gating auf TCRβ + CD4 +-Zellen (Abb. 1B, linken, oberen rechten Quadranten). Ein Beitrag Sortieren Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit der CD4 T-Zellen (Abb. 1B, rechts) zu bestimmen. TCRβ Färbung ist auf der x-Achse und CD4-Färbung auf der y-Achse dargestellt. Der prozentuale Anteil positiver Zellen in jedem Quadranten dargestellt. <!– Abbildung 2. Die Reinheit der Milz CD4 T-Zellen nach FACS. Murine Milz-T-Zellen wurden durch die Entfernung von B-Zellen durch Schwenken bereichert. Anschließend wurden die Zellen mit anti-Maus-TCRβ und CD4 Antikörper (linkes Bild) gefärbt. FACS wurde mit einem BD FACS Aria durch Gating auf TCRβ + CD4 +-Zellen (links, rechts oben quadrant). Ein Beitrag Sortieren Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit der T-Zellen, die größer als 99% (rechts) war zu bestimmen. TCRβ Färbung ist auf der x-Achse und CD4-Färbung auf der y-Achse dargestellt. Der prozentuale Anteil positiver Zellen in jedem Quadranten dargestellt. ->

Discussion

FACS ist ein hochentwickeltes Verfahren zur Reinigung von Zellpopulationen von Interesse, in denen eine sehr hohe Reinheit (95-100%) der sortierten Population erhalten werden kann. Daher ist diese Technik besonders wichtig für Experimente, bei denen hohe Reinheit ist eine wesentliche Voraussetzung (zB Microarray-Analyse). FACS ist besonders vorteilhaft gegenüber anderen verfügbaren Methoden der Reinigung, wenn eine Zelle Bevölkerung muss auf der Grundlage einer wöchentlichen ausgedrückt Oberflächenmarker gereinigt werden oder wenn zwei oder mehr Populationen zu reinigende, die verschiedenen Ebenen der Ausdruck der gleichen Oberfläche Marker haben werden müssen. Zum Beispiel die Reinigung der Randzone B-Zellen (B220 ⁺ CD21 ^hallo CD23 ^{int / niedrig)} und follikulärem B-Zellen (B220 ⁺ CD21 ^{int / low} CD23 ^hallo) auf Expression von CD21 und CD23 auf. Ein weiterer wachsender Anwendung von FACS ist Single cell sorting ermöglicht die Analyse einzelner Zellen (3, 4). FACS ist auch allgemein zu sortieren Zellen, die fluoreszierende Proteine, die genetisch ausgedrückt werden, wie grün fluoreszierende Protein markierte Proteine ​​(5) verwendet. Wenn eine sterile Art durchgeführt wird können die Zellen kultiviert werden. Allerdings kann die Lebensfähigkeit der Zellen und die Ausbeute bei der Sortierung beeinträchtigt werden. Die Lebensfähigkeit kann durch eine Zell-abhängige optimale Temperatur für die Sortierung und Verarbeitung Sammelröhrchen unmittelbar nach ihrer Kapazität zu erreichen verbessert werden. Die Wiederherstellung kann durch Verwendung von Polypropylen-Röhrchen, das Sammeln sortierten Zellen im Serum von Rich Media und Invertieren Sammelröhrchen intermittierend, Pflege-Röhrchen bei einer optimalen Temperatur und Zentrifugieren sortierten Zellen für ca. 10 min (http://cyto.mednet.ucla.edu erhöht werden / Protocol.htm).

Die Entwicklung von Ultra-High-Speed-Sorter hat die Möglichkeit, die Anwendung von Flow Sortierung in klinischen Umgebungen erweitert. Die mögliche klinische Anwendungen der FACS gehören Reinigung von Blut-Stammzellen aus menschlichem Blut zu therapeutischen Zwecken, Anwendungen in der Krebstherapie, Amniozentese Ersatz-, Sortier-menschlichen Spermien und Früherkennung von Krankheiten Erkennungen (6, 7).

Für mehrfarbige Färbung wird Antikörperselektion ein wichtiger Schritt und Fluorochrome beruhen auf dem Nachweis-System für die jeweilige Instrument gewählt. Es gibt eine Reihe von Unternehmen, die Zellsortern und der Laser-Konfiguration variiert verkaufen nach den Bedürfnissen der Benutzer. So kann man nicht einfach verwenden genau die gleichen Antikörper in veröffentlichten Studien ohne Bestätigung Kompatibilität verwendet. Für eine optimale Antikörper Auswahl, sollte man die Expression des Proteins untersucht. Im Allgemeinen sollten die hellsten verfügbaren Fluorochrom-markierten Antikörper verwendet, um schwach ausgedrückt Oberflächenmarker Fleck, während dim Fluorochrome für die Färbung von stark exprimierten Oberflächenmarker (8) verwendet werden können. Darüber hinaus Antikörper sollten in einer Weise, dass unter ihren Emissionsspektren Überlappung gewählt werden, ist minimal. Für mehrfarbige Färbung, ist es äußerst schwierig zu entscheiden Fluorochrom, dass keine spektrale Überlappung. In dieser Situation ist die Entschädigung durchgeführt.

Kompensation ist notwendig, um mathematisch zu eliminieren die Fluoreszenz Überschneidungen zwischen den Emissionen Spektrum der verschiedenen Fluorochrome, die messbar von den Detektoren (8-10) ist. In anderen Worten ist die Überlappung Fluoreszenz von einem Fluorochrom aus dem Emissionsspektrum eines anderen Fluorochrom abgezogen. Die Ausgleichsrechnung erfordert eine ungefärbte Kontrolle und einzigen positiven Kontrollen für jedes Fluorochrom für eine mehrfarbige Färbung (9, 10). Eine Entschädigung kann unter Verwendung von Zellen oder Perlen werden. Die Perlen sind leicht zu färben, haben ein robustes Signal und bieten eine einfache Möglichkeit zur Herstellung von einzelnen Flecken Steuerelemente, die die gleichen Fluorophoren wie die experimentellen Proben haben. Compensation Perlen sind besonders vorteilhaft, wenn der Zelloberfläche Protein von Interesse auf einem niedrigen Niveau exprimiert wird und wenn die Zellpopulation von Interesse ist in der Anfangsphase ab Zellpopulation begrenzen.

Sobald der Antikörper ausgewählt wurden, sollte ihre Aktivität durch die Durchführung einer Titration Analyse optimiert werden. Dies ist besonders wichtig, wenn der FACS-Maschine hat sehr leistungsfähige Laser. Die Verwendung von suboptimalen Konzentrationen der Färbung Antikörper können in schlechten Abtrennung der gewünschten Zellpopulation aus der gesamten Zellpopulation führen. Die Verwendung von hohen Antikörper-Konzentrationen erhöht die Chance für Antigen nicht-spezifische Färbung. Deshalb Antikörper-Titration ermöglicht die Auswahl der Antikörper-Konzentration, die maximale Helligkeit des positiven Bevölkerung und minimale Hintergrundfärbung (8) gibt.

FACS ist heute ein Standard-Technik für die Reinigung von Subpopulationen von Zellen. Es kann benutzt werden, um jeden Zelltyp, in denen eine einzige Zellsuspension erzeugt und können Antikörper verfügbar sind, um die gewünschte Zellpopulation zu identifizieren trennen. FACS ist die Methode der Wahl, wenn highly reine Zellpopulationen sind erforderlich.