L'uso di SC1 (Pluripotin) a supporto Mesc auto-rinnovamento in assenza di LIF

Summary

SC1 funzioni attraverso la doppia inibizione di Ras-GAP e ERK1. Abbiamo testato la funzione di SC1 nel sostenere ES cellule del mouse di auto-rinnovamento, in assenza di LIF e ha dimostrato che SC1 è in grado di mantenere auto-rinnovamento delle colture di cellule ES topo.

Abstract

Topo staminali embrionali (ES), le cellule sono coltivate in modo convenzionale con fattore inibente la leucemia (LIF) per mantenere l'auto-rinnovamento.¹ Comunque, LIF è costoso e l'attivazione del pathway LIF/JAK/STAT3 non è assolutamente necessaria per mantenere l'auto-rinnovamento dello Stato.² Il SC1 piccola molecola potrebbe essere un'alternativa economica a LIF. SC1 funzioni attraverso la doppia inibizione di Ras-GAP e ERK1.<sup> 3</supIllustrazione> del suo meccanismo d'azione lo rende uno strumento utile per studiare il meccanismo molecolare fondamentale di auto-rinnovamento. Qui mostriamo la procedura per la coltura delle cellule di topo ES in presenza di SC1 e dimostrare che sono in grado di mantenere auto-rinnovamento, in assenza di LIF. Cellule in coltura con SC1 mostrato morfologia simile rispetto alle cellule mantenute con LIF. Entrambi i quali dimostrano tipica morfologia ES del mouse dopo cinque passaggi. Tipica espressione di marcatori di pluripotenza (Oct4, Sox2, Nanog, e SSEA1) è stata osservata dopo cinque passaggi in presenza di SC1. Inoltre, SC1 non ha causato tossicità manifesta in cellule staminali embrionali del mouse.

Protocol

1. Preparazione delle piastre alimentatore MEF Un giorno prima che le cellule ES coltura, scongelare un flaconcino del combustibile irraggiato E14.5 CF-1 alimentatore cellule MEF (vedi la nostra procedura su come scongelare le cellule ES). Piastra le cellule MEF alimentatore ad una densità di 10.000 cellule / pozzetto in un piatto ben 12. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C e 5% di CO 2. MEF cellula media: DMEM supplementato con 10% ES-PBS 1X 1X glutammina e aminoacidi non essenziali. 2. Manutenzione di auto-rinnovamento delle cellule ES mouse Staccare le cellule ES con tripsina. Seed le cellule ad una densità di 50.000 cellule / pozzetto sui piatti MEF precedentemente preparato alimentatore in terreni di coltura (MEM Knockout integrata con il 15% KSR, 4 mM L-glutammina, 0,1 mM di aminoacidi non essenziali e 1X BME) integrata con SC1 alla concentrazione desiderata (abbiamo usato 100 nm, 300 nm e 1 micron). Abbiamo anche aggiunto un controllo positivo che è stato integrato con 1000 μ / ml di LIF. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C e 5% di CO 2. Coltura le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2 per 3-4 giorni in ogni passaggio. Aggiornare i media ogni 48 ore. Cellule passaggio 1:10-1:15 con tripsina per mantenere una densità simile a quella della densità di semina iniziale. Dopo 5 passaggi, le cellule possono essere esaminati per l'espressione di marcatori tipici pluripotenza utilizzando immunocitochimica. 3. Esame immunocitochimica di marcatori pluripotenza Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS. Fissare le cellule con 500 ml di fissativo per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS. Blocca legame non specifico con 500 microlitri di buffer bloccando per un'ora a temperatura ambiente. Incubare le cellule con 250 microlitri di anticorpo specifico primario (abbiamo usato Nanog, Sox2, SSEA1, e Oct4 alle diluizioni seguente: 1:500, 1:2000, 1:500 e 1:500) Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS. Incubare le cellule con 250 microlitri di anticorpo secondario per due ore a temperatura ambiente, mantenendo al riparo dalla luce (abbiamo usato asino anti-topo coniugati con Alexa Fluor ® 555 a 1:2000 e asino anti-coniglio coniugato con Alexa Fluor ® 488 a 1 : 2000). Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS. Aggiungi DAPI (concentrazione finale 1 mg / ml) per l'ultimo lavaggio e incubare 5 minuti per visualizzare nuclei. Analizzare le cellule al microscopio a fluorescenza. 4. Rappresentante dei risultati: 1. Morfologia risultati: Topo cellule staminali (ESC R1) sono stati coltivati ​​su cellule alimentatore MEF in presenza di uno o LIF SC1 per sostenere auto-rinnovamento in uno stato indifferenziato. Dopo il secondo passaggio, la differenziazione potrebbe essere osservato nelle cellule senza LIF o SC1 (controllo negativo) e dopo 5 passaggi essenzialmente non indifferenziato colonie sono state osservate. LIF (controllo positivo) colonie trattate è rimasto in uno stato indifferenziato tutto il 5 passaggi cellula. Cellule trattate con SC1 a concentrazioni di 300 Nm o 100 nM anche rimasto indifferenziato dopo 5 passaggi, tuttavia, le cellule trattate con 1 mM SC1 morte cellulare sperimentato dopo il passaggio quarto. (Fig. 2 della nota app) La tabella 1 riassume le osservazioni morfologiche. 2. Espressione di marcatori pluripotenza Le cellule staminali del mouse effettuato per 5 passaggi sono stati fissati ed esaminate mediante immunocitochimica per SSEA1, Oct4, Sox2 e Nanog. Espressione marcatore era simile alle cellule mantenute in LIF. (Fig. 3 e 4 della nota applicazione) Figura 1: confronto Morfologia di cellule mantenute in LIF o SC1. Nessuna differenza è stata osservata nella morfologia. Figura 2 e Figura 3: Nanog, SSEA1, Sox2 e Oct4 colorazione delle cellule ES mantenuto con SC1 o LIF (fig. 4 della nota app). Cellule mantenute in SC1 spettacolo simile espressione pluripotenza marcatore per le cellule mantenute in LIF. Tabella 1 Controllo Negativo LIF controllo positivo SC1 1um SC1 300 nm SC1 100 nM 1 Passage Normale morfologia delle cellule ES Normale morfologia delle cellule ES Normale morfologia delle cellule ES Normale morfologia delle cellule ES Normale morfologia delle cellule ES Passaggio 2 Alcuni morfologia differenziata E normaleS morfologia delle cellule Normale morfologia delle cellule ES Normale morfologia delle cellule ES Normale morfologia delle cellule ES Passaggio 3 Maggior parte delle cellule differenziate Normale morfologia delle cellule ES Normale morfologia delle cellule ES Normale morfologia delle cellule ES Normale morfologia delle cellule ES Passaggio 4 Nessun ESC colonie Normale morfologia delle cellule ES La morte cellulare osservata Normale morfologia delle cellule ES Normale morfologia delle cellule ES Passaggio 5 differenziato Normale morfologia delle cellule ES La morte cellulare osservata Normale morfologia delle cellule ES Normale morfologia delle cellule ES

Discussion

Il SC1 piccola molecola può essere utilizzata per mantenere auto-rinnovamento con uno stato indifferenziato delle cellule ES mouse. Prima di utilizzare su una linea cellulare non testato, comunque, dovrebbe essere titolato per determinare la concentrazione ottimale. Per esempio, abbiamo testato tre concentrazioni sulla cellula del mouse ES linea ESC R1. 100 nM e 300 nM concentrazioni sono stati in grado di sostenere le cellule staminali embrionali del mouse, invece, una concentrazione 1 mM era tossico.

SC1 può essere utilizzato anche sotto alimentatore senza condizioni.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
SC1		Stemgent	04-0011
LIF		Millipore	ESG1107
SSEA-1 antibody		Santa Cruz	21702
Nanog antibody		Abcam	ab21603
Sox2 antibody		Chemicon	Ab5603
Oct4 antibody		Santa Cruz	SC-5279