ELIME（免疫磁気電気化学的にリンクされた酵素）マイコトキシンの検出方法

Summary

競争力のある免疫化学的方法に基づいて新たに開発されたスクリーニング方法を用いてトリコテセン（ヒトの健康に対する懸念のマイコトキシン）を検出すると、最終的な電気化学的検出が実証されているプロトコル。

Abstract

イムノアッセイは、より高価で時間のかかる定量的なHPLCやGC ^1、食料品の危険なマイコトキシンのスクリーニング検出のための^2つの方法への有効な代替手段です。このプロトコルでは、プラットフォームを感知するなど、免疫化学チェーン³とスクリーン印刷電極の固体支持体として磁性ビーズの使用に基づいて、リンクされた免疫アッセイを作製し、電気化学的競争力のある酵素を尋問する方法を示します。

提案手法では、HT – 2とT – 2毒素の総量、トリコテセンの家族と人間の健康⁴の大きな懸念の属するマイコトキシンを決定することを目的とする。 HT – 2とT – 2に向かって100％の交差反応性抗体のクローンの使用は、同時に同じような感度⁵で両方の毒素を検出することができます。

私たちの分析の最初のステップは、我々は磁気ビーズの表面にHT2 – KLH複合体の毒素を固定化コーティングのステップです。非固有の吸収を避けるために必要なブロッキングのステップ、後に、モノクローナル抗体の添加は、HT – 2とフリーHT – 2やT – 2試料中に存在するか、標準液に溶解固定化との間の競争が可能になります。

競争のステップの終了時に、固定化HT – 2にリンクされているモノクローナル抗体の量は、試料溶液中の毒素の量に反比例します。

アルカリホスファターゼ（AP）で標識二次抗体を特異的抗体と固定化HT – 2の間の結合を明らかにするために使用されます。最後の測定ステップは、スクリーン印刷された作用電極の表面に、特定のサンプル/標準溶液に対応する磁気ビーズ懸濁液のアリコートを、ドロップすることによって実行されます。磁気ビーズは、下に正確に配置磁石により固定化し、そして濃縮されていますスクリーン印刷電極。磁気ビーズとAPの基質との間のインキュベーションの2分後、酵素製品は、ポータブル機器（PalmSens）数秒以内の間隔で自動的にeight測定を開始することを用いて微分パルスボルタンメトリー（DPV）によって検出されます。

Protocol

1）被覆磁気ビーズをブロッキング： 被覆磁気ビーズをブロックするために以下のように進んでください： 2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブのセットを準備します。 （揺れがボルテックスではない）ミキサーを回転させるサンプルを用いてコーティングされた磁気ビーズを（被覆磁性ビーズの調製のための付録を参照）ホモジナイズ。 す?…

Discussion

生体分子認識プローブとしての抗体の使用は、センシング技術の普及を見ている、そのようなELISAおよびMEIAsなどの免疫化学的検出手法は、多くの研究室⁷で最も使用されると適用されるプラットフォームの間で、今日では、です。

これらのアプローチは、優れた感度と特異性を達成しながら、過去数年間で多くの研究グループの主な目的は、彼らのパフォーマン?…

Materials

Reagents

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Potassium chloride	Sigma	P9333
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma	P9791
Disodium hydrogen phosphate	Sigma	S3264
Sodium chloride	Sigma	S3014
MgCl2 anhydrous	Sigma	M8266
DEA (99.5%)	Sigma	31589
HCl 37%	Sigma	320331
H3BO3	Sigma	B6768
Tris[hydroxymethyl]-aminomethane	Sigma	252859
BSA (albumin bovine serum)	Sigma	A4503
NaOH	Sigma	S5881
TWEEN 20	Sigma	P9416
NaN3	Aldrich	71290
1-Naphthyl phosphate disodium salt	Fluka	N7255
Skimmed milk blocking solution – non fat dry milk	Bio-Rad	170-6404
HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS):	Biopure	004050	The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N’-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage.
Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml.	Vector Laboratories	AP-2000
HT-2 toxin	Biopure
Magnetic beads: Dynabeads®	Dynal	M-280 Tosylactivated	Concentration 2 x 109 beads/ml.

Solutions

Name of the reagent	Preparation	Comments (optional)
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water
Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8	Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water.
Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5	Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water.
TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5	Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water.
TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4	Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4.	This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + TWEEN® 0.05%	Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4
PBS buffer + BSA solution 0.1%	Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3.	This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02%	Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3.	Storage solution
Enzymatic substrate	Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil.	This solution must be freshly prepared on the day of use.
Skimmed milk blocking solution	Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3.	This solution must be freshly prepared on the day of use.
HT-2 stock solution	Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml.	Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C.
HT-2 Working standard solution	Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin.	This solution should be freshly prepared on the day of use.
HT-2 Working calibrant solutions	Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml.	These solutions must be prepared fresh on the day of use.
HT-2 conjugated with KLH	Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl.	Store aliquots at -30 °C.
Specific Monoclonal Antibody	Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step	This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples.
Secondary Labeled Antibody	Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step.	100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use.

Apparatus

Name of the reagent	Company	Comments (optional)
Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S	Dynal
PalmSens instrument	PalmSens	Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software
CH8 PalmSens Multiplexer	PalmSens
Eight channel Mux electric contact	hand made
Strip with eight screen printed electrodes (SPEs)	hand made
Specially designed support for electrodes strip	hand made	Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE
Calibrated microliter pipettes	Gilson
Magnetic stirrer and stir bars.
Glass beakers (100, 50, 20 ml).
Volumetric flasks (2ml).
0.2 and 2ml Eppendorf tubes.	Eppendorf
Falcon™ tubes of 5ml and 15ml.	Falcon
Laboratory Vortex Mixer		Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts
Laboratory oven or thermostated room		Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C.