ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic électrochimique) Méthode de détection des mycotoxines

Résumé

Un protocole pour détecter les trichothécènes (mycotoxines de préoccupation pour la santé humaine) en utilisant une méthode de dépistage nouvellement développé basé sur une méthode immunochimique compétitifs et une détection électrochimique dernière est démontrée.

Résumé

Les immunoessais sont une alternative valable à la plus coûteuse en temps et consommer HPLC quantitative ou GC ^{1, 2} méthodes de dépistage pour la détection de mycotoxines dans les denrées alimentaires dangereuses. Dans ce protocole, nous montrons comment fabriquer et d'interroger une enzyme électrochimique de dosage immuno-concurrentiel lié basé sur l'utilisation de billes magnétiques comme support solide pour la chaîne immunochimiques ³ et électrodes sérigraphiées que la détection de la plate-forme.

Notre méthode vise à déterminer la quantité totale de HT-2 et T-2 toxines, les mycotoxines appartenant à la famille des trichothécènes et de grande préoccupation pour la santé humaine ^4. L'utilisation d'un clone d'anticorps avec une réactivité croisée de 100% vers la HT-2 et T-2 permet de détecter simultanément deux toxines avec une sensibilité similaire ^5.

La première étape de notre analyse est l'étape de revêtement où nous immobilisent toxine conjugué HT2-KLH sur la surface de billes magnétiques. Après une étape de blocage, nécessaire pour éviter les absorptions non spécifiques, l'ajout d'un anticorps monoclonal permet la concurrence entre immobilisé HT-2 et HT-2 gratuitement ou T-2 présents dans l'échantillon ou dissous dans une solution standard.

A la fin de l'étape la concurrence, la quantité d'anticorps monoclonaux liés à l'immobilisation HT-2 sera inversement proportionnelle à la quantité de toxine dans la solution échantillon.

Un anticorps secondaire marqué à la phosphatase alcaline (AP) est utilisée pour révéler la liaison entre l'anticorps spécifique et l'immobilise HT-2. L'étape finale est effectuée la mesure par la chute d'une partie aliquote de la suspension de billes magnétiques, correspondant à un échantillon / solution de norme spécifique, sur la surface d'un écran-imprimés électrode de travail; billes magnétiques sont immobilisés et concentré au moyen d'un aimant placé exactement sous le sérigraphié électrode. Après deux minutes d'incubation entre les billes magnétiques et un substrat pour l'AP, le produit enzymatique est détecté par Differential Pulse Voltamétrie (DPV) en utilisant un instrument portatif (PalmSens) également en mesure de lancer automatiquement les huit mesures dans un intervalle de quelques secondes.

Protocole

1) Le blocage des billes magnétiques revêtues:

Procédez comme suit pour bloquer billes magnétiques recouvertes:

1. Préparer un ensemble de deux tubes Eppendorf ml;
2. Homogénéiser (secousses, mais pas vortex) de billes magnétiques recouvertes (voir l'annexe pour la préparation des billes magnétiques recouvertes) en utilisant l'échantillon tournant mélangeur;
3. Immédiatement après homogénéisation, une pipette 10 ul de billes magnétiques recouvertes dans chaque tubes Eppendorf distinctes;
4. Ajouter 1 ml de lait écrémé en solution de blocage dans chacun des tubes Eppendorf de l'ensemble;
5. Lais....

Discussion

L'utilisation d'anticorps comme sonde de reconnaissance biomoléculaire a vu une utilisation généralisée des technologies de détection; méthodes de détection immunochimiques, tels que ELISA et MEIAs, sont, aujourd'hui, parmi les plateformes les plus utilisées et appliquées dans de nombreux laboratoires ^7.

Bien que ces approches obtenir une sensibilité et une spécificité exceptionnelle, un objectif premier de nombreux groupes de recherche dans les dernières années a été .......

Matériaux

Réactifs

Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Le chlorure de potassium	Sigma	P9333
Phosphate monopotassique	Sigma	P9791
Phosphate disodique	Sigma	S3264
Le chlorure de sodium	Sigma	S3014
MgCl 2 anhydre	Sigma	M8266
DEA (99,5%)	Sigma	31589
HCl 37%	Sigma	320331
H 3 BO 3	Sigma	B6768
Tris [hydroxyméthyl] aminométhane	Sigma	252859
BSA (albumine sérique bovine)	Sigma	A4503
NaOH	Sigma	S5881
TWEEN 20	Sigma	P9416
NaN 3	Aldrich	71290
1-naphtyl phosphate de disodium	Fluka	N7255
Solution de lait écrémé blocage - de lait écrémé sec	Bio-Rad	170-6404
HT-2 conjugué avec KLH (Keyhole Limpet Keyhole), solution mère (1 mg / ml dans PBS):	Biopure	004050	Le conjugué HT-2-KLH a été obtenue par le CDI-méthode où la libre circulation des groupes OH en position 3 et 4 de la toxine HT-2 ont été activés par le N, N'-carbonyldiimidazole (CDI) et l'activation de toxine HT-2 a été laissez réagir avec groupes amino de la protéine (KLH) pour générer un lien carbammate stable.
Secondaire anticorps marqué: IgG anti-souris (H + L) de cheval, conjugué à la phosphatase alcaline, la concentration de 1 mg / ml.	Vector Laboratories	AP-2000
La toxine HT-2	Biopure
Les billes magnétiques: Dynabeads ®	Dynal	M-280 Tosylactivated	Concentration 2 x 10 9 billes / ml.

Solutions

Nom du réactif	Préparation	Commentaires (optionnel)
Tampon phosphate salin (PBS), pH 7,4	Dissoudre 0,20 g de chlorure de potassium, 0,20 g de dihydrogénophosphate de potassium, 1,16 g de phosphate disodique et 8,00 g de chlorure de sodium dans 900 ml d'eau
Tampon diéthanolamine, DEA, 0,97 m + 1 mM de MgCl2 + 0,15 M de KCl, pH 9,8	Dissoudre 0.0476g de MgCl 2 anhydre et 7.3.59 g de KCl dans ~ 300 ml d'eau. Après dissolution, ajouter 51 ml de DEA (99,5%). Ajuster le pH à 9,8 avec HCl (6 M). Diluer à 500 ml avec de l'eau.
Tampon borate 0,1 M pH 9,5	Dissoudre 3,09 g de H 3 BO 3 en ~ 300 ml d'eau distillée, ajuster le pH à 9,5 avec NaOH et / ou HCl (6 M ou des concentrations plus faibles). Diluer à 500 ml d'eau distillée.
Tampon TRIS, 0,2 M, pH 8,5	Dissoudre 3,85 g de Tris [hydroxyméthyl] aminométhane dans 100 ml d'eau. Ajuster le pH à 8,5 avec NaOH et / ou HCl (6 M ou des concentrations plus faibles). Diluer à 200 ml avec de l'eau.
Tampon TRIS + BSA solution (0,1%), pH 8,4	Dissoudre 0,050 g de BSA dans 50 ml de tampon TRIS pH 8,4.	Cette solution doit être fraîchement préparée le jour d'utilisation.
Tampon PBS + TWEEN ® 0,05%	Dissoudre 0,250 g de Tween 20 dans 500 ml de tampon PBS préparé préalablement, pH 7,4
Tampon PBS + BSA solution à 0,1%	Dissoudre 0,050 g de BSA dans 50 ml de tampon PBS, pH 7,3.	Cette solution doit être fraîchement préparée le jour d'utilisation.
Tampon PBS + BSA 0,1% + 0,02% NaN3	Dissoudre 0,050 g de BSA et 0,010 de NaN 3 dans 50 ml de tampon PBS, pH 7,3.	Stockage Solution
Substrat enzymatique	Dissoudre 0,010 g de 1-naphtyl phosphate de sel de sodium dans 100 ml de tampon DEA pH 9,8. Envelopper le ballon d'serré dans du papier aluminium.	Cette solution doit être fraîchement préparée le jour d'utilisation.
Solution de lait écrémé bloquant	Ajouter 0,20 g de Blotting grade bloqueur non-lait écrémé en poudre (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) pour 200 ml de tampon PBS pH 7,3.	Cette solution doit être fraîchement préparée le jour d'utilisation.
Solution stock HT-2	Dissoudre 10 mg de trichothécènes HT-2 flacon de toxine, dans 10 ml d'acétonitrile pour donner une solution avec une concentration de 1 mg / ml.	Répartis cette solution dans des aliquotes à usage unique de 30 ml et de les stocker à moins de -30 ° C.
HT-2 Solution étalon de travail	Pipeter 20 ml de HT-2 solution stock de toxine dans un 2 ml calibré fiole jaugée et diluer avec de l'acétonitrile pour obtenir une solution HT-2 de travail contenant 10 ug / ml de toxine trichothécènes.	Cette solution doit être fraîchement préparée le jour d'utilisation.
HT-2 solutions calibrant travail	Diluer le HT-2 solution étalon de travail (10 pg / ml) pour préparer la solution de travail calibrant 100 ng / ml. Diluer HT-2 travaille solution d'étalonnage à 100 ng / ml pour préparer des solutions de travail calibrant des concentrations suivantes 0 (blanc), 0,5, 1, 2, 4, 10 ng / ml.	Ces solutions doivent être fraîchement préparés le jour d'utilisation.
HT-2 conjugué avec KLH	Répartis HT-2 conjugué avec une solution stock de KLH (Keyhole Limpet Keyhole) (1 mg / ml dans PBS) en usage unique des aliquotes de 350 pi.	Aliquotes magasin à -30 ° C.
Anticorps monoclonal spécifique	Diluer 1:350 (v: v) la concentration des stocks (1,383 mg / ml) d'anticorps monoclonaux dans le PBS à utiliser dans l'étape la compétition	Cette solution doit être fraîchement préparés au moment de l'utiliser. 10 ml de solution mère d'anticorps dans PBS pour un volume final de 3,5 ml, sont suffisantes pour analyser les 17 normes et / ou des échantillons.
Secondaire anticorps marqué	IgG anti-souris (H + L), conjugué à la phosphatase alcaline est dilué 1:100 (v: v) dans du PBS à utiliser dans l'étape concurrence.	Solution 100 ul d'actions d'anticorps dans PBS pour un volume final de 10 ml, sont suffisantes pour analyser les 25 normes et / ou des échantillons. Cette solution doit être fraîchement préparés au moment de l'utiliser.

Un appareil

Nom du réactif	Société	Commentaires (optionnel)
Concentrateur de particules magnétiques: MPC-S ®	Dynal
Instrument PalmSens	PalmSens	Fourni avec PalmSens Lite, Serial PC portable câble de connexion et le logiciel Mux options
CH8 PalmSens Multiplexeur	PalmSens
Huit canaux de contact Mux électriques	fabriqués à la main
Bande avec huit électrodes sérigraphiées (EVS)	fabriqués à la main
Spécialement conçu pour soutenir la bande électrodes	fabriqués à la main	Comprend 8 aimants néodyme dont chacune est placée en dessous de chaque surface de l'électrode de travail de la SPE
Pipettes calibrées microlitre	Gilson
Agitateur magnétique et barreaux d'agitation.
Béchers en verre (100, 50, 20 ml).
Fioles jaugées (2ml).
0.2 et 2ml tubes Eppendorf.	Eppendorf
Tubes Falcon ™ de 5ml et 15ml.	Falcon
Laboratoire Vortex		Ne pas utiliser vortex pour resuspendre billes magnétiques recouvertes d'HT2-KLH ou liés à la chaîne immunologiques afin d'éviter la dénaturation des pièces protéiques
Four de laboratoire ou la salle thermostaté		Choisissez un four capable de garder une température de 37 ± 3 ° C.