Isolamento e purificazione di Drosophila Neuroni periferici da Magnetic Ordinamento Bead
Summary
In questo video-articolo vi presentiamo un metodo per l'isolamento e la purificazione di<em> Drosophila</em> Neuroni periferici utilizzando un digiuno perla magnetica assistita strategia di separazione delle cellule. RNA ottenuti da cellule isolate possono essere facilmente utilizzato per applicazioni a valle comprese le analisi di microarray.
Abstract
Il<em> Drosophila</em> Sistema nervoso periferico (PNS) è un modello potente per indagare i complessi processi di sviluppo neuronale e morfogenesi dendrite a livello funzionale e molecolare. Per facilitare queste analisi, abbiamo sviluppato una strategia per l'isolamento di una sottoclasse di neuroni PNS chiamato arborizzazione dendritica (bis) i neuroni che sono stati ampiamente utilizzati per studiare la morfogenesi dendrite<sup> 1,2</sup>. Questi neuroni sono molto difficili da isolare come una popolazione pura, dovuto in parte al loro verificarsi estremamente bassa e la loro difficile da raggiungere, posizione sotto la cuticola chitinosa dura larvale. Il nostro metodo di nuova concezione supera queste sfide, e si basa su un arricchimento delle cellule veloce e specifici utilizzando sfere magnetiche legate agli anticorpi. Per i nostri studi magnetici ordinamento tallone, abbiamo usato pari età larve terzo instar esprimere un mouse CD8 tag proteina di fusione GFP (<em> UAS-mCD8-GFP</em>)<sup> 3</sup> Sotto il controllo sia della arborizzazione dendritica classe IV (bis)-neurone specifico<em> Borseggiatore (PPK)-GAL4</em> Autista<sup> 4</sup> O il controllo del pan-da neuroni specifici GAL4<sup> 21-7</sup> Autista<sup> 5</sup>. Anche se questo protocollo è stato ottimizzato per isolare le cellule PNS che sono attaccati alla parete interna della cuticola larvale, variando alcuni parametri, il protocollo di poter essere utilizzata per isolare molti tipi cellulari diversi collegato alla cuticola a stadi larvali o pupe di sviluppo (per esempio epiteli, muscolo, oenocytes ecc), o altri tipi di cellule di organi larvale a seconda della GAL4 specifico modello di driver di espressione. L'RNA isolato con questo metodo è di alta qualità e può essere facilmente utilizzata per analisi genomiche a valle, come gli studi di espressione genica profiling microarray. Questo approccio offre un nuovo e potente strumento per svolgere studi di isolati<em> Drosophila</em> Arborizzazione dendritica (bis) i neuroni fornendo così nuove intuizioni sui meccanismi molecolari alla base della morfogenesi dendrite.
Protocol
Discussion
Il protocollo presentato qui è ottimizzato per l'isolamento e la purificazione dei neuroni periferici che aderiscono strettamente alla superficie interna della cuticola terzo Drosophila instar larvale con una perla magnetica strategia di separazione delle cellule. Mentre abbiamo usato questo protocollo per isolare specificamente Drosophila neuroni da applicazioni di questo protocollo per l'isolamento di altri tipi di cellule che aderiscono alla cuticola in stadi larvali o pupe di sviluppo (per esempio epiteli, …
Acknowledgements
Ringraziamo Drs. Yuh-gen Nung e Wes Grueber per la fornitura di scorte di volo utilizzato in questo studio. Gli autori riconoscono la F. Thomas e Kate Miller Jeffress Memorial Trust per il supporto di questa ricerca (DNC) e l'Ufficio George Mason University Provost (EPRI).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | Roche | 11814176001 | Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial) | |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml stock concentration | |
| BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V | GibcoBRL | 11018-017 | Prepare a 1% BSA solution in PBS | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11205D | 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
Equipment
- (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used.
- Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002)
- Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407)
- 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004)
- Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20)
- Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08)
- Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips
- Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity
- Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration
- Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g)
- Vortex
- Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).
