の単離と精製ショウジョウバエ末梢ニューロン
Summary
このビデオ、記事では、の単離および精製のための方法を提示<em>ショウジョウバエ</em高速磁気ビーズアシスト細胞選別の戦略を使用して>末梢神経。単離された細胞から得られたRNAは、容易にマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーションに使用することができます。
Abstract
市販<em>ショウジョウバエ</em>末梢神経系（PNS）は、機能と分子レベルでのニューロンの発達と樹状突起の形態形成の複雑なプロセスを調査するための強力なモデルです。これらの分析を支援するために、我々は、広く樹状突起の形態形成を研究するために使用されている樹状分枝（DA）ニューロンと呼ばれるPNSニューロンのサブクラスの分離のための戦略を開発している<sup> 1,2</sup>。これらのニューロンは、部分的にそれらの非常に低い発生と厳しいキチン質の幼虫のクチクラ下の彼らの困難な到達位置のために、純粋な集団として分離するのは非常に困難です。新たに開発した手法は、これらの課題を克服し、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いて迅速かつ特異的な細胞の濃縮に基づいています。私たちの磁気ビーズソーティング研究のために、我々はマウスCD8タグ付けされたGFPの融合タンパク質を（表現する年齢をマッチさせた三齢幼虫を用いている<em> UAS – mCD8 – GFP</em>）<sup> 3</sup>クラスIVの樹状突起の分枝のどちらかの制御下にある（DA）ニューロン特異的<em>スリ（PPK）- GAL4</em>ドライバー<sup> 4</sup>またはパン- DAニューロン特異的GAL4の制御<sup> 21から7</sup>ドライバー<sup> 5</sup>。このプロトコルは、いくつかのパラメータを変化させることによって、幼虫のクチクラの内壁に付着しているPNSの細胞を単離するために最適化されているが、同じプロトコルはの幼虫or蛹の段階で表皮に接続されている多くの異なる細胞型を分離するために使用することができるGAL4固有のドライバの発現パターンに応じて幼虫の器官からの開発（例えば上皮、筋肉、oenocytesなど）、または他の細胞型。この方法により単離されたRNAは高品質のものであり、容易にこのようなマイクロアレイの遺伝子発現プロファイリング研究のような下流のゲノム解析に使用することができます。このアプローチは、分離の研究を実行する強力な新しいツールを提供しています<em>ショウジョウバエ</em>樹状分枝（DA）ニューロンは、それによって樹状突起形態形成の分子メカニズムに新たな洞察を提供しています。
Protocol
Discussion
ここで紹介するプロトコールは、磁気ビーズ細胞選別の戦略を用いてショウジョウバエの三齢幼虫のクチクラの内側の表面に強固に付着末梢神経細胞の単離および精製のために最適化されています。我々は特にショウジョウバエのDAニューロンを分離するためにこのプロトコルを使用している一方で、開発の幼虫または蛹の段階で表皮に付着する他の細胞型の分離にこのプロトコル（例えば?…
Acknowledgements
我々は、博士に感謝する。塩原-ティンニン本研究で使用されてこない系統を提供するための月とウェスGrueber。著者らはこの研究の支援（DNC）とジョージメイソン大学の学長のオフィス（EPRI）のためにトーマスF.とケイトミラーJeffressメモリアルトラストを認める。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | Roche | 11814176001 | Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial) | |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml stock concentration | |
| BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V | GibcoBRL | 11018-017 | Prepare a 1% BSA solution in PBS | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11205D | 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
Equipment
- (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used.
- Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002)
- Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407)
- 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004)
- Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20)
- Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08)
- Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips
- Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity
- Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration
- Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g)
- Vortex
- Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).
