의 분리 및 정제 Drosophila 주변 뉴런
Summary
이 동영상 기사에서 우리는의 분리 및 정제를위한 방법을 제시<em> Drosophila</em빠른 자석 구슬 도움 셀 정렬 전략을 사용하기> 주변 뉴런. 분리된 세포에서 얻은 RNA는 쉽게 microarray 분석을 포함하여 하류 어플 리케이션에 사용할 수 있습니다.
Abstract
<em> Drosophila</em> 주변 신경계 (PNS)는 기능과 분자 수준에서의 연결을 개발 및 dendrite의 morphogenesis의 복잡한 프로세스를 조사위한 강력한 모델입니다. 이러한 분석에 도움이하기 위해, 우리는 PNS의 신경의 하위 클래스의 고립을위한 전략 돌기 arborization (DA) 널리 dendrite morphogenesis을 공부에 사용되었습니다 뉴런이라는 개발<sup> 1,2</sup>. 이들 뉴런은 힘든 chitinous 애벌레 표피 아래에 위치를 도달하기 어려운 매우 순수 인구로 분리하기 어려운 그들의 매우 낮은 발생하는 부분 때문에 그들입니다. 우리의 새로 개발된 방법은 이러한 문제를 극복하고, 항체 – 코팅 자기 구슬을 사용하여 신속하고 특정 세포 강화에 따라 달라집니다. 우리 자기 비드 정렬 연구, 우리는 마우스 CD8 태그 GFP 융합 단백질을 (표현 나이에 일치하는 세번째 instar의 애벌레를 사용한<em> UAS – mCD8 – GFP</em>)<sup> 3</sup> 클래스 IV의 돌기의 arborization 하나의 제어하에 (DA) 신경 세포 특정<em> 소매치기 (PPK) GAL4</em> 드라이버<sup> 4</sup> 또는 팬 – DA 뉴런 특정 GAL4의 통제<sup> 21-7</sup> 드라이버<sup> 5</sup>. 이 프로토콜은 몇 가지 매개 변수를 변화하여 애벌레 표피의 내부 벽에 연결된 PNS 세포를 분리에 최적화된되어 있지만, 같은 프로토콜의 애벌레 또는 pupal 단계에서 표피에 부착된 여러 세포 유형을 분리하는 데 사용될 수 개발 (예 : 상피 조직, 근육, oenocytes 등), 또는 GAL4 특정 드라이버 표현 패턴에 따라 애벌레 기관에서 다른 세포 유형. 이 방법에 의해 분리된 RNA는 높은 품질이며 쉽게 이러한 microarray 유전자 발현 프로 파일링 연구로 하류 게놈 분석을 위해 사용될 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 격리에 대한 연구를 수행하는 강력한 새로운 도구를 제공합니다<em> Drosophila</em따라서 dendrite morphogenesis를 기본 분자 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공> 돌기 arborization (DA) 뉴런.
Protocol
Discussion
여기에 제시 프로토콜은 자기 비드 셀 정렬 전략을 사용하여 Drosophila 셋째 instar 애벌레의 표피의 내부 표면에 단단히 고수 주변 뉴런의 분리 및 정제에 최적입니다. 우리가 구체적으로 애벌레 또는 개발의 pupal 단계에있는 표피에 맞게 다른 세포 유형의 고립이 프로토콜의 Drosophila 뭐냐 뉴런, 응용 프로그램을 분리하기 위해이 프로토콜을 사용하는 동안 (예 : 상피 조직, 근육, 기타 말초 신경)에 ?…
Acknowledgements
우리는 DRS 감사합니다. Yuh – Nung 본 연구에 사용된 비행 주식을 제공하고 월 웨스 Grueber. 저자 토마스 F.와 케이트 밀러 제프리스 기념이 연구의 지원 트러스트 (DNC)와 조지 메이슨 대학 프로보츠 사무소 (EPRI)을 인정합니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | Roche | 11814176001 | Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial) | |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml stock concentration | |
| BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V | GibcoBRL | 11018-017 | Prepare a 1% BSA solution in PBS | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11205D | 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
Equipment
- (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used.
- Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002)
- Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407)
- 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004)
- Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20)
- Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08)
- Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips
- Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity
- Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration
- Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g)
- Vortex
- Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).
