Isolamento e purificação de Drosophila Neurônios periféricos por classificação Bead Magnética
Summary
Neste vídeo-artigo apresentamos um método para o isolamento e purificação de<em> Drosophila</em> Neurônios periféricos usando um jejum magnética estratégia de triagem talão assistida celular. RNA obtido a partir de células isoladas podem ser facilmente usados para aplicações a jusante, incluindo análises microarray.
Abstract
O<em> Drosophila</em> Sistema nervoso periférico (PNS) é um poderoso modelo para investigar os processos complexos de desenvolvimento neuronal e morfogênese dendrite a nível funcional e molecular. Para auxiliar nestas análises, temos desenvolvido uma estratégia para o isolamento de uma subclasse de neurônios chamado PNS arborização dendrítica (da) neurônios que têm sido amplamente utilizados para estudar a morfogênese dendrite<sup> 1,2</sup>. Esses neurônios são muito difíceis de isolar como uma população pura, em parte devido à sua ocorrência extremamente baixa e sua difícil de alcançar localização abaixo da cutícula quitinosa resistente larval. Nosso método recém-desenvolvido supera estes desafios, e é baseado em uma célula de enriquecimento rápido e específico utilizando anticorpos revestido esferas magnéticas. Para os nossos estudos de triagem magnética talão, temos utilizado pareados por idade larvas de terceiro estádio expressar um rato CD8 proteína de fusão com a tag GFP (<em> UAS-mCD8-GFP</em>)<sup> 3</sup> Sob o controle tanto da arborização dendrítica classe IV (da) neurônio-específica<em> Pickpocket (PPK)-GAL4</em> Driver<sup> 4</sup> Ou o controle da pan-da GAL4 neurônio-específica<sup> 21-7</sup> Driver<sup> 5</sup>. Embora este protocolo foi optimizado para isolar PNS células que estão ligados à parede interna da cutícula larval, variando alguns parâmetros, o mesmo protocolo pode ser usado para isolar muitos tipos de células diferentes ligados à cutícula nas fases larval e pupal de desenvolvimento (por exemplo, epitélios, músculo, oenocytes etc), ou outros tipos de células de órgãos larval, dependendo do padrão de expressão GAL4 driver específico. O RNA isolada por este método é de alta qualidade e pode ser facilmente usado para jusante análises genômicas, tais como gene microarray estudos de perfil de expressão. Esta abordagem oferece uma nova e poderosa ferramenta para realizar estudos sobre isolado<em> Drosophila</em> Dendríticas arborização (da) neurônios proporcionando conhecimentos novos sobre os mecanismos moleculares subjacentes à morfogênese dendrite.
Protocol
Discussion
O protocolo aqui apresentado é otimizado para o isolamento e purificação de neurônios periféricos que aderem firmemente à superfície interna do estádio terceiro Drosophila cutícula larval usando uma estratégia de triagem magnética talão celular. Embora tenhamos utilizado este protocolo especificamente para isolar neurônios da Drosophila, aplicações deste protocolo para o isolamento de outros tipos de células que se aderem à cutícula larval ou na fase de pupa de desenvolvimento (por exemplo, epitélios,…
Acknowledgements
Agradecemos a drs. Yuh-Nung Jan e Wes Grueber para a prestação de stocks voar utilizados neste estudo. Os autores agradecem o F. Thomas e Kate Miller Jeffress Memorial Trust para o apoio desta pesquisa (DNC) e do Gabinete do Reitor da Universidade George Mason da (EPRI).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | Roche | 11814176001 | Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial) | |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml stock concentration | |
| BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V | GibcoBRL | 11018-017 | Prepare a 1% BSA solution in PBS | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11205D | 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
Equipment
- (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used.
- Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002)
- Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407)
- 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004)
- Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20)
- Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08)
- Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips
- Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity
- Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration
- Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g)
- Vortex
- Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).
