Выделение и очистка Drosophila Периферийные Нейроны магнитными бисера Сортировка
Summary
В этом видео-работе предлагается метод выделения и очистки<em> Drosophila</em> Периферические нейроны с помощью быстрого магнитного бусинка помощь стратегию сортировки клеток. РНК получена из изолированных клеток могут быть легко использованы для последующих применений, включая микрочипов анализа.
Abstract
<em> Drosophila</em> Периферической нервной системы (ПНС) является мощной моделью для исследования сложных процессов развития и нейронных дендритов морфогенеза на функциональном и молекулярном уровнях. Для помощи в этих анализах, мы разработали стратегию для выделения подкласса нейронов ПНС называемых дендритных разветвление (DA) нейроны, которые нашли широкое применение для изучения морфогенеза дендритов<sup> 1,2</sup>. Эти нейроны очень трудно выделить в качестве чистого населения, отчасти из-за их крайне низкую частоту, и их трудно в труднодоступных места ниже жесткие хитиновые личиночной кутикулы. Наш недавно разработанный метод позволяет преодолеть эти проблемы, и основан на быстрой и конкретной ячейке обогащения с использованием покрытых антителами магнитных бус. Для нашего исследования магнитных бусинка сортировки, мы использовали соответствующего возраста личинок третьего возраста выражения мыши CD8 меченый белок GFP синтеза (<em> UAS-mCD8-GFP</em>)<sup> 3</sup> Под контролем либо дендритных разветвление класса IV (да) нейрон конкретных<em> Карманника (ППК)-GAL4</em> Драйвер<sup> 4</sup> Или контроль пан-да-нейрон-специфический GAL4<sup> 21-7</sup> Драйвер<sup> 5</sup>. Хотя этот протокол был оптимизирован для изоляции ПНС клеток, которые прикрепляются к внутренней стенке личиночной кутикулы, путем изменения нескольких параметров, и тот же протокол может быть использован для выделения различных типов клеток, придает кутикулы на личиночной или куколки стадиях развития (например, эпителий, мышцы, oenocytes т.д.), или другие типы клеток из личиночных органов в зависимости от конкретных GAL4 выражению водителя. РНК, выделенной с помощью этого метода отличается высоким качеством и могут быть легко использованы для анализа геномной вниз по течению, такие как ген микрочипов исследования выражение профилирования. Этот подход предлагает новый мощный инструмент для выполнения исследований на изолированных<em> Drosophila</em> Дендритных разветвление (да) нейронов тем самым обеспечивая роман взглянуть на молекулярные механизмы, лежащие дендритов морфогенеза.
Protocol
Discussion
Протокол, представленные здесь, оптимизированная для выделения и очистки периферических нейронов, которые придерживаются сильно, чтобы внутренняя поверхность дрозофилы третьего возраста личиночной кутикулы с помощью магнитного бусинка стратегии сортировки клеток. Хотя мы использо…
Acknowledgements
Мы благодарим доктора. Yuh-Нунг Ян и Уэс Grueber за предоставление летать запасы, используемые в данном исследовании. Авторы признают, Томас Ф. и Кейт Миллер Джеффресс Мемориального Фонда за поддержку этого исследования (РСК) и Управления Университета Джорджа Мейсона благочинного (EPRI).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | Roche | 11814176001 | Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial) | |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml stock concentration | |
| BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V | GibcoBRL | 11018-017 | Prepare a 1% BSA solution in PBS | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11205D | 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
Equipment
- (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used.
- Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002)
- Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407)
- 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004)
- Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20)
- Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08)
- Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips
- Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity
- Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration
- Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g)
- Vortex
- Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).
