Aislamiento y purificación de Drosophila Clasificación de las neuronas periféricas por bolas magnéticas
Summary
En este video-artículo se presenta un método para el aislamiento y purificación de<em> Drosophila</em> Neuronas periféricas con una rápida estrategia de asistencia con bolas magnéticas clasificación de células. ARN obtenido a partir de las células aisladas pueden ser fácilmente utilizada para aplicaciones posteriores incluyendo el análisis de microarrays.
Abstract
La<em> Drosophila</em> Del sistema nervioso periférico (SNP) es un poderoso modelo para la investigación de los complejos procesos de desarrollo neuronal y la morfogénesis de las dendritas a nivel funcional y molecular. Para ayudar en estos análisis, hemos desarrollado una estrategia para el aislamiento de una subclase de las neuronas PNS llamada arborización dendrítica (da), las neuronas que han sido ampliamente utilizados para el estudio de la morfogénesis dendrita<sup> 1,2</sup>. Estas neuronas son muy difíciles de aislar en una población pura, debido en parte a su ocurrencia muy baja y su-difícil de alcanzar ubicación por debajo de la cutícula larval dura de quitina. Nuestro nuevo método supera estos desafíos, y se basa en una celda de enriquecimiento rápido y específico mediante anticuerpos recubiertos con partículas magnéticas. Para nuestros estudios magnéticos clasificación de cuentas, hemos utilizado la misma edad larvas de tercer estadio que expresa una proteína del ratón CD8 etiquetado de fusión GFP (<em> UAS-GFP-mCD8</em>)<sup> 3</sup> Bajo el control de cualquiera de la arborización dendrítica de clase IV (da) neuronal específica<em> Carterista (PPK)-GAL4</em> Conductor<sup> 4</sup> O el control de la pan-da neuronal específica GAL4<sup> 21-7</sup> Conductor<sup> 5</sup>. Aunque este protocolo ha sido optimizado para aislar las células PNS que se unen a la pared interna de la cutícula de las larvas, mediante la variación de algunos parámetros, el mismo protocolo que podría ser utilizado para aislar diferentes tipos de células adjunta a la cutícula en las etapas de larva o pupa desarrollo (por ejemplo, epitelios, muscular, etc oenocytes), u otros tipos de células de los órganos de las larvas dependiendo del modelo de driver GAL4 expresión específica. El ARN aislado por este método es de alta calidad y puede ser fácilmente utilizada para posteriores análisis genómico, tales como estudios de microarrays perfiles de expresión génica. Este enfoque ofrece una nueva y poderosa herramienta para llevar a cabo estudios sobre el aislamiento<em> Drosophila</em> Arborización dendrítica (da), las neuronas lo que proporciona nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares subyacentes a la morfogénesis de dendritas.
Protocol
Discussion
El protocolo que aquí se presenta ha sido optimizado para el aislamiento y purificación de las neuronas periféricas, que se adhieren firmemente a la superficie interna de la Drosophila cutícula tercer estadio larval con un cordón magnético de la estrategia de clasificación de células. A pesar de que han utilizado este protocolo para aislar específicamente Drosophila neuronas da, la aplicación de este protocolo para el aislamiento de otros tipos de células que se adhieren a la cutícula de las larvas o pupas d…
Acknowledgements
Agradecemos a los Dres. Yuh-Nung Jan y Grueber Wes para proporcionar poblaciones de moscas utilizadas en este estudio. Los autores agradecen la F. Thomas y Kate Miller Jeffress Memorial Trust para el apoyo de esta investigación (DNC) y la Oficina de la Universidad George Mason Provost (EPRI).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | Roche | 11814176001 | Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial) | |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml stock concentration | |
| BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V | GibcoBRL | 11018-017 | Prepare a 1% BSA solution in PBS | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11205D | 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
Equipment
- (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used.
- Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002)
- Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407)
- 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004)
- Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20)
- Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08)
- Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips
- Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity
- Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration
- Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g)
- Vortex
- Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).
