İzolasyon ve Arıtma Drosophila Periferik Nöronlar
Summary
Bu video makalede, izolasyonu ve saflaştırılması için bir yöntem mevcut<em> Drosophila</em> Hızlı bir manyetik boncuk destekli hücre sıralama stratejisi kullanarak periferik nöronlar. Izole hücrelerinden elde edilen RNA kolayca mikroarray analizleri de dahil olmak üzere alt uygulamalar için kullanılabilir.
Abstract
<em> Drosophila</em> Periferik sinir sistemi (PNS), fonksiyonel ve moleküler düzeyde nöronal gelişim ve dendrit morfolojilerinden karmaşık süreçleri araştırmak için güçlü bir model. Bu analizlerde yardımcı olmak için, dendritik arborization (da) dendrit morfolojilerinden çalışmak için yaygın olarak kullanılan nöron adı verilen bir alt sınıfıdır PNS nöronların izolasyonu için bir strateji geliştirmiştir<sup> 1,2</sup>. Bu nöronlar sert chitinous larva manikür altında konuma ulaşmak için çok zor saf bir nüfus olarak izole etmek için son derece düşük bir olay nedeniyle zor ve. Yeni geliştirilen yöntem, bu zorlukları aşar ve antikor kaplı manyetik boncuklar kullanarak hızlı ve belirli bir hücre zenginleştirme dayanmaktadır. Manyetik boncuk sıralama çalışmaları için, bir fare CD8 etiketli GFP füzyon proteini (ifade yaş eşleştirilmiş üçüncü instar larvaları kullanmış<em> UAS-mCD8-GFP</em>)<sup> 3</sup> Sınıfı IV dendritik arborization ya kontrol altında nöron spesifik (da)<em> Pickpocket (PPK)-GAL4</em> Driver<sup> 4</sup> Ya da pan-da nöron-spesifik GAL4 kontrolü<sup> 21-7</sup> Driver<sup> 5</sup>. Bu protokol, birkaç parametre değişen, larva manikür iç duvara bağlı PNS hücreleri izole etmek için optimize edilmiş olsa da, aynı protokolü larva veya pupa aşamasında manikür bağlı birçok farklı hücre türleri izole etmek için kullanılır. geliştirme (örneğin epitel, kas, oenocytes vb), veya GAL4 özel sürücü ifade desen bağlı olarak larva organların diğer hücre türleri. Bu yöntem ile izole RNA yüksek kalitede ve kolayca mikroarray gen ekspresyon profili çalışmaları gibi downstream genomik analizler için kullanılabilir. Bu yaklaşım, izole çalışmaları gerçekleştirmek için yeni ve güçlü bir araç sunar<em> Drosophila</emBöylece dendrit morfolojilerinden altında yatan moleküler mekanizmaları, yeni bakış açıları sunan dendritik arborization (da) nöronlar.
Protocol
Discussion
Burada sunulan protokol, bir manyetik boncuk hücre sıralama stratejisi kullanarak Drosophila üçüncü instar larva manikür iç yüzeyine sıkıca yapışır periferik nöronların izolasyon ve saflaştırılması için optimize edilmiştir. Bu protokolün Drosophila da nöronların, uygulamalar, özellikle larva veya pupa aşamalarında gelişme manikür bağlı diğer hücre türleri izolasyon izole etmek için bu protokolü kullanılır olsa da (örneğin epitel, kas, diğer çevre nöronlar) tarafından adapte e…
Acknowledgements
Biz Dr teşekkür ederim. Yuh-Nung Jan ve Wes Grueber Bu çalışmada kullanılan uçucu stokları sağlamak için. Yazarlar Thomas F. ve bu araştırma desteği için Kate Miller Jeffress Memorial Trust (DNC) ve George Mason Üniversitesi Provost Ofisi (EPRI) kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | Roche | 11814176001 | Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial) | |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml stock concentration | |
| BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V | GibcoBRL | 11018-017 | Prepare a 1% BSA solution in PBS | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11205D | 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
Equipment
- (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used.
- Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002)
- Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407)
- 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004)
- Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20)
- Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08)
- Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips
- Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity
- Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration
- Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g)
- Vortex
- Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).
