Быстрое высокой пропускной метод картирования рибонуклеопротеиды (мяРНП) по правам пре-мРНК

Summary

Из-за переходного характера пре-мРНК, это может быть трудно выделить и изучать<em> В естественных условиях</em>. Здесь мы представляем роман<em> В пробирке</em> Подход к исследованию РНК-белковых взаимодействий использованием синтетических бассейн олиго, что плитки через отдельных регионах пре-мРНК.

Abstract

Секвенирование РНК, которые совместно иммунопреципитации (со-IP) с РНК связывающих белков увеличилась наше понимание сплайсинга, продемонстрировав, что обязательным месте часто влияет на функции сращивания фактор. Однако, как и любая стратегия выборки шанс выявления РНК связаны с фактором сплайсинга пропорциональна его сотовый изобилии. Мы разработали новый подход в пробирке для съемки специфичность связывания по иным переходных пре-мРНК. Этот подход использует специально разработанные олигонуклеотидных пула, плитки по интроны, экзоны, сращивание переходов, или другие пре-мРНК. Бассейн подвергается какой-то молекулярной селекции. Здесь мы демонстрируем метод, разделив олигонуклеотида в связанные и несвязанные фракции и использовать два цвета массива стратегии для записи обогащение каждый нуклеотид в связанной фракции. Массив данных генерирует высокое разрешение карты с возможностью определить последовательности конкретных и структурных determinates из рибонуклеопротеидных (RNP) обязательны для пре-мРНК. Уникальное преимущество этого метода состоит в его способности, чтобы избежать предвзятого отношения к выборки мРНК связано с текущими IP и SELEX технике, как бассейн, специально разработаны и синтезированы из пре-мРНК последовательности. Гибкость олигонуклеотидных бассейн является еще одним преимуществом поскольку экспериментатор выбирает, какие регионы для изучения и плитки в поперечнике, пошив бассейн с их индивидуальными потребностями. Используя эту технику, можно анализе эффектов полиморфизма или мутаций на обязательными для крупных размерах или клон библиотеки в функциональном репортер сплайсинга и определить, что олигонуклеотиды обогащены включены фракции. Этот роман в пробирке с высоким разрешением схема отображения представляет собой уникальный способ изучения RNP взаимодействия с преходящими пре-мРНК видов, которых низкое содержание затрудняет их изучение с действующим в естественных методов.

Protocol

Дизайн бассейна и олиго восстановления Первый шаг заключается в разработке пре-мРНК бассейн предстоит изучить. Это может быть сделано с помощью браузера УСК геноме и загрузку определенных генов, сращивания переходы, или других областей, представляющих интерес. После окон с…

Discussion

При выполнении этой процедуры его важно помнить, что создание пула гибкими и открытыми для модификации либо на РНК или белка. На уровне РНК ортологичных регионах, болезнь мутаций, полиморфизмов, или случайные мутации могут быть введены в олигонуклеотидные последовательности. На уровн?…