मानचित्रण Ribonucleoproteins के लिए एक रैपिड मानव पूर्व mRNA पर उच्च throughput विधि (RNPs)

Summary

पूर्व mRNA की क्षणिक प्रकृति के कारण, यह अलग है और अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो सकता है<em> Vivo में</em>. यहाँ, हम एक उपन्यास वर्तमान<em> इन विट्रो में</em> शाही सेना, प्रोटीन बातचीत एक सिंथेटिक oligo पूल का उपयोग कर जांच दृष्टिकोण है कि पूर्व mRNA की चयनित क्षेत्रों में टाइल.

Abstract

RNAs के अनुक्रमण है कि शाही सेना बंधनकारी प्रोटीन के साथ सह immunoprecipitate (सह आईपी) splicing की हमारी समझ बढ़ गया है कि बाध्यकारी स्थान प्रदर्शन करके अक्सर एक splicing कारक के समारोह को प्रभावित करती है. हालांकि, के रूप में किसी भी नमूने रणनीति के साथ एक एक splicing कारक के लिए बाध्य शाही सेना की पहचान करने का मौका उसके सेलुलर बहुतायत आनुपातिक है. हम अन्यथा पूर्व mRNA क्षणिक पर बाध्यकारी विशिष्टता सर्वेक्षण करने के लिए इन विट्रो दृष्टिकोण में एक उपन्यास विकसित किया है. यह दृष्टिकोण एक विशेष रूप से डिजाइन oligonucleotide पूल का इस्तेमाल कि introns, exons, ब्याह जंक्शनों, या पूर्व mRNA अन्य भर टाइल. पूल आणविक चयन के कुछ प्रकार के अधीन है. यहाँ, हम एक ही है और अनबाउंड अंश में अलग oligonucleotide द्वारा विधि का प्रदर्शन और एक दो रंग सरणी के लिए बाध्य अंश में प्रत्येक oligonucleotide के संवर्धन के रिकॉर्ड की रणनीति का उपयोग. सरणी डेटा अनुक्रम विशिष्ट और संरचनात्मक ribonucleoprotein (RNP) के पूर्व mRNA पर बाध्यकारी determinates की पहचान करने की क्षमता के साथ उच्च संकल्प नक्शे उत्पन्न. इस विधि के लिए एक अनूठा लाभ अपने वर्तमान आईपी और SELEX तकनीकों के साथ जुड़े mRNA की ओर नमूना पूर्वाग्रह से बचने की क्षमता है, के रूप में पूल और विशेष रूप से डिज़ाइन किया गया है पूर्व mRNA अनुक्रम से संश्लेषित. oligonucleotide पूल के लचीलेपन के एक और लाभ यह है के बाद से अध्ययन और टाइल भर experimenter जो क्षेत्रों को चुनता है, अपनी व्यक्तिगत जरूरतों के लिए पूल सिलाई. इस तकनीक का उपयोग, एक बहुरूपताओं या एक बड़े पैमाने पर बंधन या एक कार्यात्मक splicing संवाददाता में पुस्तकालय क्लोन और oligonucleotides कि शामिल अंश में समृद्ध कर रहे हैं की पहचान पर परिवर्तन के प्रभाव को परख कर सकते हैं. इन विट्रो उच्च संकल्प मानचित्रण योजना में इस उपन्यास क्षणिक पूर्व mRNA प्रजातियों, जिसका कम बहुतायत उन्हें vivo में तकनीक में वर्तमान के साथ अध्ययन करने के लिए कठिन बना देता है के साथ RNP बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा तरीका प्रदान करता है.

Protocol

पूल डिजाइन और oligo वसूली पहला कदम पूर्व mRNA पूल डिजाइन करने के लिए अध्ययन किया जा रहा है. यह UCSC जीनोम ब्राउज़र का उपयोग कर और विशेष जीन, ब्याह जंक्शनों, या हित के अन्य क्षेत्रों को डाउनलोड किया जा सकता है ह…

Discussion

जब यह प्रक्रिया कर रही अपनी महत्वपूर्ण है कि पूल के निर्माण को याद या तो शाही सेना या प्रोटीन के स्तर पर लचीला और संशोधन के लिए खुला है. शाही सेना के स्तर पर orthologous क्षेत्रों, रोग म्यूटेशनों, बहुरूपताओं, या ?…