Un rapide à haut débit Méthode de cartographie ribonucléoprotéines (RNP) sur l'homme pré-ARNm

Résumé

En raison de la nature transitoire de pré-ARNm, il peut être difficile d'isoler et d'étudier In vivo. Ici, nous présentons un roman In vitro Approche pour étudier les interactions ARN-protéine en utilisant un pool de synthèse oligo que les carreaux de toutes les régions sélectionnées du pré-ARNm.

Résumé

Séquençage ARN que la co-immunoprécipitation (co-IP) avec protéines liant l'ARN a amélioré notre compréhension de l'épissage en démontrant que l'emplacement contraignante influence souvent fonction d'un facteur d'épissage. Cependant, comme toute stratégie d'échantillonnage les chances d'identifier un ARN lié à un facteur d'épissage est proportionnelle à son abondance cellulaire. Nous avons développé une nouvelle approche in vitro pour l'arpentage spécificité de liaison sur les autres transitoires pré-ARNm. Cette approche utilise un bassin spécialement conçu oligonucléotidiques que les carreaux dans les introns, des exons, jonctions d'épissage, ou d'autres pré-ARNm. La piscine est soumis à une sorte de sélection moléculaire. Ici, nous démontrons la méthode par séparation des oligonucléotides en une fraction liée et non liée et d'utiliser une stratégie à deux couleurs ensemble pour enregistrer l'enrichissement de chaque oligonucléotide dans la fraction liée. Les données du tableau génère cartes à haute résolution avec la possibilité d'identifier des séquences spécifiques et structurelles des déterminants ribonucléoprotéines (RNP) liant pré-ARNm. Un avantage unique de cette méthode est sa capacité à éviter les biais d'échantillonnage en direction ARNm associés à la PI et techniques actuelles SELEX, comme la piscine est spécifiquement conçu et synthétisé à partir de pré-ARNm séquence. La flexibilité de la piscine oligonucléotide est un autre avantage puisque l'expérimentateur choisit les régions à l'étude et la tuile à travers, en adaptant la piscine à leurs besoins individuels. En utilisant cette technique, on peut doser l'effet des polymorphismes ou des mutations sur la liaison à grande échelle ou d'un clone de la bibliothèque dans une journaliste épissage fonctionnels et d'identifier des oligonucléotides qui sont enrichis dans la fraction incluse. Ce roman in vitro de haute résolution schéma de mappage offre un moyen unique d'étudier les interactions avec les RNP transitoires pré-ARNm espèces, dont la faible abondance les rend difficiles à étudier avec cours techniques in vivo.

Protocole

Piscine de conception et oligo récupération

1. La première étape consiste à concevoir la piscine pré-ARNm d'être étudiée. Cela peut être fait en utilisant le navigateur de génome UCSC et le téléchargement de certains gènes, jonctions d'épissage, ou d'autres domaines d'intérêt.
2. Une fois que les fenêtres d'intérêt ont été sélectionnées, les carreaux à travers eux de calcul utilisant les conditions suivantes: longueur de lecture devrait être de 30 nucléotides avec un nucléotide 10 se chevauchent, donc chaque oligo est décalée 20 nucléotides de l'un préalable. * Chevauchent Oligo devrait être augmenté à proximité des sites d'épissage pour assurer une co....

Discussion

Lorsque vous effectuez cette procédure il est important de se rappeler que la création de la piscine est flexible et ouverte à la modification que ce soit au niveau de l'ARN ou de protéines. Au niveau de l'ARN régions orthologues, les mutations des maladies, des polymorphismes ou des mutations aléatoires peuvent être introduites dans la séquence oligonucléotidique. Au niveau protéique de l'ARN facteur de liaison peut être modifiée par phosphorylation ou d'autres modifications post traductionnelles. De pl.......