Protein transduktion möjliggör direkt leverans av biologiskt aktiva proteiner i celler. I motsats till konventionella metoder såsom DNA transfektion eller viral transduktion denna icke-invasiv paradigmet tillåter mycket effektiva cellulära manipulation i en titrerbar sätt kringgå cellulär toxicitet och risken för onkogena förvandling genom permanenta genetisk modifiering.
Proteinet transduktion Tekniken gör det möjligt att direkt leverans av biologiskt aktiva material in i däggdjursceller [för granskning se 1,2]. För detta kan man använda sig av translocating förmåga så kallad cell penetrerande peptider (CPP), som även utsetts domäner protein transduktion (PTDs). TAT-CPP härrör från humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) Tat (trans-aktivator av transkription) protein har i stor utsträckning. Den positivt laddade TAT främjar cell permeabilitet så vis komma över de barriärer av cellulära membran genom endocytos och / eller direkt membran penetration 2. I kombination med en nukleär lokalisering signal (LMV) fusionsproteiner kan komma in i kärnan uppvisar funktionalitet. Vår videopresentation visar, som en exemplifiering för verkstadsindustrin av cell-genomsläppliga proteiner, konstruktion, produktion och tillämpning av en cell-genomsläppliga version av den DNA-modifiera enzymet Cre.
Cre är en platsspecifik recombinase som kan känna igen och kombinera 34 bas webbplatser par loxP i däggdjursceller in vitro och in vivo. Därför Cre / loxP-systemet används ofta för att villkorligt framkalla mutationer i genomet hos levande celler 3,4. Leveransen av aktiva Cre recombinase till celler, utgör dock en begränsning.
Vi beskriver pSESAME vektor system, vilket möjliggör en direkt att genen-av-intresse och ger en plattform för att snabbt klona olika domäner och taggar används inom vektor på ett bekvämt och standardiserat sätt. Ordna de olika taggarna har visat att ändra biokemiska egenskaper fusionsproteiner ger en möjlighet att uppnå högre avkastning och bättre löslighet. Vi visar hur uttrycka och rena rekombinanta cell-permeant proteiner i och från E. coli. Funktionaliteten av rekombinanta Cre proteinet lagfästas i cellkultur genom att bedöma dess intracellulära recombinase aktivitet.
Under reningsprocessen av Cre fusionsproteinet är det viktigt att inte utelämna tillägg av iskall TBS buffert före centrifugering. Annars Cre recombinase tenderar att fälla i glycerol buffert.
Om eluatet bråkdel verkar bli grumligt på grund av den höga koncentrationen av fusionsprotein ytterligare elueringen buffert bör läggas förrän lösningen har rensat igen.
Tillämpningen av 10 mikrometer i Cre fusionsprotein resulterar normalt i en rekombination verkningsgrad på 80 till 100%. Fetalt kalvserum (FCS) är en viktig komponent i ES-celler medelstora starkt hämmar proteinsyntesen transduktion. Därför är hög koncentration av Cre recombinase måste användas. När du arbetar i serum-fria förhållanden mindre protein (0,5 – 2 ìm) kan användas för att uppnå liknande rekombination effektivitet.
Med pSESAME vektorsystem till hands kan man använda tekniken av protein transduktion till andra proteiner, inklusive transkriptionsfaktorer som Oct4 och Sox2 7 och Scl/Tal1 8.
Vi tackar Oliver Brüstle och alla medlemmar av Stem Cell Engineering Group, universitetet i Bonn, för stöd och värdefulla diskussioner. Vi tackar Sabine Schenk för beredning av SDS-PAGE och bestående stöd under hela projektet. Nicole Russ och Anna Magerhans som utmärkt teknisk support. Dessutom vill vi tacka Andreas Bar och Sheila Mertens för produktionen av filmen. Detta arbete har finansierats med bidrag från Volkswagen Foundation (Az I/77864) och det tyska ministeriet för utbildning och forskning (BMBF, 01 GN 0813).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
TUNER (DE3) pLacI | Novagen | 70625 | ||
Glycerol | Carl Roth | 3783.2 | ||
Na2HPO4 | Roth | T876.1 | ||
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | ||
HCl | Roth | 4625.1 | ||
Imidazol | Roth | X998.4 | ||
NaCl | Roth | 9265.2 | ||
Yeast Extract | Roth | 2363.4 | ||
Trypton/Pepton | Roth | 8952.4 | ||
K2HPO4 | Roth | P749.2 | ||
KH2PO4 | Roth | 3904.1 | ||
Ampicillin | Sigma | A9518 | ||
Carbenicillin | Sigma | 6344.2 | ||
HEPES | Sigma | H3375 | ||
Lysozyme | Sigma | 62971 | ||
Benzonase | Novagen | |||
L-Tartaric acid, disodium salt | Sigma | |||
50% Ni-NTA slurry | Invitrogen | R901-15 | ||
EconoPac columns | Biorad | 732-1010 | ||
Sterile filter 0,22μm | Whatman | |||
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | |||
LB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl | |||
TB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4 | |||
Lysis Buffer | 50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8 | |||
Tartaric Salt Buffer (TSB) | PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol | |||
Washing Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol | |||
Elution Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol | |||
High Salt Buffer | 600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | |||
Gylcerol Buffer | 50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | |||
TrypLE™ Express | Invitrogen | |||
ESGRO (LIF) | Millipore | |||
NEAA | Gibco | 11140035 | ||
L-Glutamin | Gibco | 25030024 | ||
β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | ||
DMEM | Gibco | 11960044 | ||
PBS | Gibco | |||
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA | |||
X-Gal staining solution: | 4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS |
|||
K3(FeIII(CN)6) | Sigma | P-3367 | ||
K4 (FeII(CN)6) | Sigma | P-9387 | ||
MgCl2 | Sigma | M8266 | ||
X-Gal | Sigma | B4252 |