Engineering Cell-genomsläppliga Protein

Summary

Protein transduktion möjliggör direkt leverans av biologiskt aktiva proteiner i celler. I motsats till konventionella metoder såsom DNA transfektion eller viral transduktion denna icke-invasiv paradigmet tillåter mycket effektiva cellulära manipulation i en titrerbar sätt kringgå cellulär toxicitet och risken för onkogena förvandling genom permanenta genetisk modifiering.

Abstract

Proteinet transduktion Tekniken gör det möjligt att direkt leverans av biologiskt aktiva material in i däggdjursceller [för granskning se ^1,2]. För detta kan man använda sig av translocating förmåga så kallad cell penetrerande peptider (CPP), som även utsetts domäner protein transduktion (PTDs). TAT-CPP härrör från humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) Tat (trans-aktivator av transkription) protein har i stor utsträckning. Den positivt laddade TAT främjar cell permeabilitet så vis komma över de barriärer av cellulära membran genom endocytos och / eller direkt membran penetration ^2. I kombination med en nukleär lokalisering signal (LMV) fusionsproteiner kan komma in i kärnan uppvisar funktionalitet. Vår videopresentation visar, som en exemplifiering för verkstadsindustrin av cell-genomsläppliga proteiner, konstruktion, produktion och tillämpning av en cell-genomsläppliga version av den DNA-modifiera enzymet Cre.

Cre är en platsspecifik recombinase som kan känna igen och kombinera 34 bas webbplatser par loxP i däggdjursceller in vitro och in vivo. Därför Cre / loxP-systemet används ofta för att villkorligt framkalla mutationer i genomet hos levande celler ^3,4. Leveransen av aktiva Cre recombinase till celler, utgör dock en begränsning.

Vi beskriver pSESAME vektor system, vilket möjliggör en direkt att genen-av-intresse och ger en plattform för att snabbt klona olika domäner och taggar används inom vektor på ett bekvämt och standardiserat sätt. Ordna de olika taggarna har visat att ändra biokemiska egenskaper fusionsproteiner ger en möjlighet att uppnå högre avkastning och bättre löslighet. Vi visar hur uttrycka och rena rekombinanta cell-permeant proteiner i och från E. coli. Funktionaliteten av rekombinanta Cre proteinet lagfästas i cellkultur genom att bedöma dess intracellulära recombinase aktivitet.

Protocol

Konstruktion av uttryck vektor och uttryck: Den pSESAME-Cre uttryck vektor byggdes genom att sätta in en Cre-kodning fragment i pSESAME via AvrII och NheI begränsning webbplatser med hjälp av vanliga kloning metoder. pSESAME kodar för ett fusionsprotein som består av en histidin-tagg, TAT-domän, NLS sekvens och Cre, förkortat HTNCre. För uttryck HTNCre de pSESAME-Cre förvandlades till TUNER (DE3) pLacI och används för att förbereda en glycerol lager. En över natten kulturen var inokuleras med en pipettspetsen belagd med förvandlade bakterier från glycerol lager. Den över-natten kultur utgjordes av LB media kompletteras med 0,5% glukos [v / v] och Carbenicillin till en slutlig koncentration av 50 mikrogram / ml och tilläts växa vid 37 ° C i 16 timmar. Nästa dag tätbevuxna över natten kulturen användes för att ympa uttrycket kulturen i förhållandet 1 till 40 och lades i en inkubator vid 37 ° C. Uttryck kultur bestod av TB media kompletteras med 0,5% glukos [v / v] och ampicillin till en slutlig koncentration av 100 mikrogram / ml. Vid en OD 595 på 1,5 uttrycket kulturen inducerade med 0,5 mM IPTG, 1 h. Därefter bakterier samlades in genom centrifugering vid 5000 rpm i 10 minuter i en SLA3000 rotorn. Bakterier pellets förvarades vid minus 20 ° C tills rening. Rening av cell-genomsläppliga protein: Frysta bakterier pellets var suspenderade i 10 ml lyseringsbuffert per liter kolv kultur i 15 minuter i rumstemperatur. Fjädring var inkuberas sedan med 1 mg / ml lysozym för ytterligare 15 minuter under omrörning i rumstemperatur. 25 U / mL bensonas lades efteråt och inkuberas under omrörning i 15 minuter i rumstemperatur. Efter sonification på is för 1,5 min med 0,5 s pulser på 45% av makten, per ml 1 ml kallt vinsyra salt buffert (TSB) suspension har omsorgsfullt lagts under omrörning och inkuberas i 5 minuter på is. SDS-PAGE urval av lysat fraktion (L) togs. Cleared lysat erhölls genom centrifugering vid 4 ° C i 30 min vid 30 tusen g. SDS-PAGE prover av lösliga (S) och olösliga fraktioner (I) togs. Supernatanten överfördes till frisk 50 ml Falcon rör och var sedan försiktigt blandas i 1 h vid 4 ° C med 2 ml 50% Ni-NTA slam per liter inledande uttryck kultur. Suspensionen packades in i en självfall EconoPac kolumn (SDS-PAGE urval av genomströmning fraktion (FT) tagit var) och tvättas två gånger med 5 säng-volymer av tvätt buffert. SDS-PAGE prover av både tvätt fraktioner (W1 och W2) samlades in. HTNCre-innehållande fraktioner var elueras med 3 bed-volymer eluering buffert och prov av eluatet fraktion (E) för SDS-PAGE analys togs. Imidazol togs bort av dialyzing eluering bråkdel mot höga saltbuffert två gånger. Proteinet Lösningen blev ytterligare koncentreras genom dialyzing mot glycerol buffert två gånger. I alla dialys steg förhållandet mellan buffert för urvalet var minst 50. Detta förfarande resulterade i en glycerol stamlösning innehåller HTNCre på en vanlig koncentration mellan 200 och 450 mikroM, så att exempelvis 1 liter uttryck kultur resulterar i ~ 12 mg protein. Exempel på glycerol lager (GS) för SDS-PAGE analys samlades in. HTNCre stamlösning kan förvaras vid minus 20 ° C. Figur 1: SDS-PAGE analys av prover som samlats in under reningsprocessen av Cre recombinase. Induktion av Cre uttryck indikeras av dominerande band i lysat fraktion. Även om en del av proteinet är olösliga i Cre protein kan ytterligare berikas som sett i eluatet och glycerol fraktioner lager. L: lysat, I: Olöslig, S: supernatanten FT: genomströmning, W: Tvätt, E: eluatet, GS: Gylcerol Stock. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1. Protein transduktion i murina embryonala stamceller (ES-celler): ES-celler bär en villkorlig β-galaktosidas reporter 5 uppföra var seedade som enskilda celler med TrypLE ™ Express för dissociation av anhängare celler. Efter 4 till 6 timmar cellerna hade re-anslutna och mediet togs bort. Därefter ES-celler inkuberades med HTNCre-innehållande medium för 16 timmar. En lämplig mängd HTNCre protein (motsvarande 10 M) ut ur glycerol lagret späddes i ES medium och därefter sterilt filtrerad (0,22 mikrometer). Efter protein transduktion medelstora byttes tillbaka till normal tillväxt medium. Efter två dagar cellerna tvättas med PBS och fixeras med 4% Paraformaldehyd (PFA) i 10 minuter. Två ytterligaretionella tvätt steg med PBS avrättades innan X-Gal färgning utfördes. Fast celler var täckta med ett lager av X-Gal färglösningen 6 och inkuberas över natten vid 37 ° C. Representativa resultat: Nästa dag X-Gal färglösningen var strävade och cellerna var täckta med ett lager av PBS för mikroskopi analys. 80 och 100% av modifierat cellerna kunde observeras i murina ES-celler bedöms av β-galaktosidas aktivitet.

Discussion

Under reningsprocessen av Cre fusionsproteinet är det viktigt att inte utelämna tillägg av iskall TBS buffert före centrifugering. Annars Cre recombinase tenderar att fälla i glycerol buffert.

Om eluatet bråkdel verkar bli grumligt på grund av den höga koncentrationen av fusionsprotein ytterligare elueringen buffert bör läggas förrän lösningen har rensat igen.

Tillämpningen av 10 mikrometer i Cre fusionsprotein resulterar normalt i en rekombination verkningsgrad på 80 till 100%. Fetalt kalvserum (FCS) är en viktig komponent i ES-celler medelstora starkt hämmar proteinsyntesen transduktion. Därför är hög koncentration av Cre recombinase måste användas. När du arbetar i serum-fria förhållanden mindre protein (0,5 – 2 ìm) kan användas för att uppnå liknande rekombination effektivitet.

Med pSESAME vektorsystem till hands kan man använda tekniken av protein transduktion till andra proteiner, inklusive transkriptionsfaktorer som Oct4 och Sox2 ⁷ och Scl/Tal1 ^8.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
TUNER (DE3) pLacI		Novagen	70625
Glycerol		Carl Roth	3783.2
Na2HPO4		Roth	T876.1
Trizma Base		Sigma-Aldrich	T1503
HCl		Roth	4625.1
Imidazol		Roth	X998.4
NaCl		Roth	9265.2
Yeast Extract		Roth	2363.4
Trypton/Pepton		Roth	8952.4
K2HPO4		Roth	P749.2
KH2PO4		Roth	3904.1
Ampicillin		Sigma	A9518
Carbenicillin		Sigma	6344.2
HEPES		Sigma	H3375
Lysozyme		Sigma	62971
Benzonase		Novagen
L-Tartaric acid, disodium salt		Sigma
50% Ni-NTA slurry		Invitrogen	R901-15
EconoPac columns		Biorad	732-1010
Sterile filter 0,22μm		Whatman
Paraformaldehyde (PFA)		Sigma
LB medium				Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl
TB medium				Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4
Lysis Buffer				50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8
Tartaric Salt Buffer (TSB)				PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol
Washing Buffer				PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol
Elution Buffer				PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol
High Salt Buffer				600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
Gylcerol Buffer				50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
TrypLE™ Express		Invitrogen
ESGRO (LIF)		Millipore
NEAA		Gibco	11140035
L-Glutamin		Gibco	25030024
β-Mercaptoethanol		Gibco	31350010
DMEM		Gibco	11960044
PBS		Gibco
Fetal Calf Serum (FCS)		PAA
X-Gal staining solution:				4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS
K3(FeIII(CN)6)		Sigma	P-3367
K4 (FeII(CN)6)		Sigma	P-9387
MgCl2		Sigma	M8266
X-Gal		Sigma	B4252