इंजीनियरिंग प्रोटीन सेल पारगम्य
Summary
प्रोटीन पारगमन कोशिकाओं में biologically सक्रिय प्रोटीन के प्रत्यक्ष वितरण के लिए सक्षम बनाता है. डीएनए अभिकर्मक या वायरल पारगमन जैसे पारंपरिक तरीकों के विपरीत इस गैर इनवेसिव प्रतिमान एक titratable सेलुलर विषाक्तता और स्थायी आनुवंशिक संशोधन के द्वारा oncogenic परिवर्तन के जोखिम circumventing तरीके में अत्यधिक कुशल सेलुलर हेरफेर की अनुमति देता है.
Abstract
प्रोटीन पारगमन तकनीक स्तनधारी कोशिकाओं में biologically सक्रिय सामग्री के प्रत्यक्ष वितरण सक्षम बनाता [समीक्षा के लिए 1,2 देख]. के लिए यह एक तथाकथित सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स (सीपीपी) के translocating क्षमता का उपयोग कर सकते हैं, यह भी प्रोटीन पारगमन डोमेन (PTDs) के रूप में नामित है. मानव इम्यूनो वायरस टाइप 1 (एचआईवी -1) जैसे प्रोटीन (प्रतिलेखन के ट्रांस – उत्प्रेरक) व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है से व्युत्पन्न जैसे सीपीपी. जैसे सकारात्मक आरोप लगाया सेल पारगम्यता जिससे endocytosis या / और प्रत्यक्ष झिल्ली 2 पैठ द्वारा सेलुलर झिल्ली की बाधाओं पर काबू पाने को बढ़ावा देता है. परमाणु स्थानीयकरण संकेत के साथ संयोजन में (NLS) संलयन प्रोटीन के नाभिक प्रदर्शन कार्यक्षमता में प्रवेश कर रहे हैं. हमारे वीडियो प्रस्तुति सेल पारगम्य प्रोटीन इंजीनियरिंग, निर्माण, उत्पादन और डीएनए संशोधित एंजाइम Cre के एक सेल पारगम्य संस्करण के आवेदन के लिए एक दृष्टांत के रूप में दर्शाता है.
Cre साइट विशिष्ट है कि recombinase को पहचाना और इन विट्रो में और vivo में 34 आधार जोड़ी loxP साइटों recombine स्तनधारी कोशिकाओं में करने में सक्षम है है. इसलिए Cre / loxP प्रणाली को व्यापक रूप से सशर्त रहने वाले 3,4 कोशिकाओं के जीनोम में परिवर्तन पैदा करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कोशिकाओं को सक्रिय Cre recombinase के वितरण, तथापि, एक सीमा का प्रतिनिधित्व करता है.
हम pSESAME सदिश प्रणाली है, जो जीन के हित के एक सीधा सम्मिलन की अनुमति देता है और एक मंच प्रदान करने के लिए तेजी से अलग डोमेन और एक सुविधाजनक और मानकीकृत तरीके में वेक्टर के भीतर का उपयोग किया टैग क्लोन का वर्णन. अलग टैग के उलटफेर संलयन करने के लिए एक उच्च उपज और बेहतर विलेयता हासिल संभावना प्रदान प्रोटीन की जैव रासायनिक गुणों को संशोधित करने के लिए दिखाया गया है. हम प्रदर्शन कैसे व्यक्त करने के लिए और में और ई. कोलाई से पुनः संयोजक सेल permeant प्रोटीन शुद्ध. पुनः संयोजक Cre प्रोटीन की कार्यक्षमता के अंत में अपनी intracellular recombinase गतिविधि का आकलन करके सेल संस्कृति में मान्य है.
Protocol
Discussion
Cre संलयन प्रोटीन की शुद्धि की प्रक्रिया के दौरान यह महत्वपूर्ण है के लिए बर्फ के ठंडे टीबीएस बफर के अलावा centrifugation से पहले नहीं चूकना. अन्यथा Cre recombinase ग्लिसरॉल बफर के भीतर वेग आदत है.
यदि eluate अंश बन करने के लिए प्रकट होता है संलयन प्रोटीन अतिरिक्त elution बफर के उच्च एकाग्रता के कारण turbid समाधान जब तक फिर से मंजूरी दे दी है जोड़ा जाना चाहिए.
Cre संलयन प्रोटीन के 10 सुक्ष्ममापी के आवेदन आमतौर पर 80 से 100% की एक पुनर्संयोजन दक्षता में परिणाम है. भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) ES सेल मध्यम के एक प्रमुख घटक होने के जोरदार प्रोटीन पारगमन रोकता. इसलिए Cre recombinase के उच्च एकाग्रता के लिए इस्तेमाल किया जा था. जब सीरम मुक्त परिस्थितियों में काम कर रहे कम प्रोटीन (0.5 – 2 सुक्ष्ममापी) के लिए इसी तरह की पुनर्संयोजन क्षमता को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
हाथ में pSESAME वेक्टर प्रणाली के साथ एक Oct4 और Sox2 7 और 8 Scl/Tal1 जैसे प्रतिलेखन कारकों सहित अन्य प्रोटीन प्रोटीन पारगमन की तकनीक लागू कर सकते हैं.
Acknowledgements
हम ओलिवर Brüstle और स्टेम सेल इंजीनियरिंग समूह, बॉन विश्वविद्यालय समर्थन और बहुमूल्य विचार – विमर्श के लिए, के सभी सदस्यों को धन्यवाद देता हूं. हम एसडीएस पृष्ठ और परियोजना भर में स्थायी समर्थन की तैयारी के लिए Sabine स्चेंक धन्यवाद. निकोल Russ और अन्ना Magerhans उत्कृष्ट तकनीकी सहायता प्रदान की है. इसके अलावा, हम फिल्म के उत्पादन के लिए Andreas बार और शीला Mertens धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम वोक्सवैगन फाउंडेशन (I/77864 AZ) और शिक्षा और अनुसंधान (BMBF, 01 GN 0,813) जर्मन मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| TUNER (DE3) pLacI | Novagen | 70625 | ||
| Glycerol | Carl Roth | 3783.2 | ||
| Na2HPO4 | Roth | T876.1 | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | ||
| HCl | Roth | 4625.1 | ||
| Imidazol | Roth | X998.4 | ||
| NaCl | Roth | 9265.2 | ||
| Yeast Extract | Roth | 2363.4 | ||
| Trypton/Pepton | Roth | 8952.4 | ||
| K2HPO4 | Roth | P749.2 | ||
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | ||
| Ampicillin | Sigma | A9518 | ||
| Carbenicillin | Sigma | 6344.2 | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | ||
| Lysozyme | Sigma | 62971 | ||
| Benzonase | Novagen | |||
| L-Tartaric acid, disodium salt | Sigma | |||
| 50% Ni-NTA slurry | Invitrogen | R901-15 | ||
| EconoPac columns | Biorad | 732-1010 | ||
| Sterile filter 0,22μm | Whatman | |||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | |||
| LB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl | |||
| TB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4 | |||
| Lysis Buffer | 50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8 | |||
| Tartaric Salt Buffer (TSB) | PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol | |||
| Washing Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol | |||
| Elution Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol | |||
| High Salt Buffer | 600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | |||
| Gylcerol Buffer | 50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | |||
| TrypLE™ Express | Invitrogen | |||
| ESGRO (LIF) | Millipore | |||
| NEAA | Gibco | 11140035 | ||
| L-Glutamin | Gibco | 25030024 | ||
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | ||
| DMEM | Gibco | 11960044 | ||
| PBS | Gibco | |||
| Fetal Calf Serum (FCS) | PAA | |||
| X-Gal staining solution: | 4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS |
|||
| K3(FeIII(CN)6) | Sigma | P-3367 | ||
| K4 (FeII(CN)6) | Sigma | P-9387 | ||
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ||
| X-Gal | Sigma | B4252 |
References
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