Mühendislik Hücre geçirgen Protein

Summary

Protein transdüksiyon biyolojik olarak aktif proteinler hücre içine doğrudan teslim sağlar. DNA transfeksiyon veya viral transdüksiyon gibi geleneksel yöntemler yerine, aksine bu non-invaziv bir paradigma hücresel toksisite ve kalıcı genetik modifikasyon onkojenik transformasyon riskini engellemeyi titrasyon bir şekilde yüksek verimli hücresel manipülasyon sağlar.

Abstract

Protein iletim tekniği, memeli hücrelerinin içine biyolojik aktif madde doğrudan teslim sağlar ^[1,2 inceleme için bakınız] . Bu yüzden adı verilen hücre delici peptidler (ABM'lerini) translocating yeteneği kullanmak için, aynı zamanda protein transdüksiyon domain (PTDs) olarak belirlenmiş. Insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) Tat (trans-transkripsiyon aktivatörü) protein yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır türetilen TAT-CPP. Olumlu ücret TAT, böylece hücre zarının endositoz ve / veya doğrudan membran ^penetrasyonu 2 engellerinin aşılması hücre geçirgenliğini artırır . Bir nükleer lokalizasyon sinyal ile birlikte (NLS) füzyon proteinleri çekirdeği sergileyen işlevselliği girebilecekler. Bizim video sunumu hücre geçirgen proteinlerin mühendislik, inşaat, üretim ve geçirgen bir hücre DNA modifiye enzim Cre sürümü uygulaması için bir örneklendirme olarak gösteriyor.

Cre memeli hücrelerinde in vitro ve in vivo olarak 34 baz çifti loxP siteleri tanımak ve rekombinasyona bir siteye özgü recombinase . Bu nedenle Cre / loxP sistemi yaygın koşullu canlı hücreler ^3,4 genom mutasyonları ikna etmek için kullanılır. Ancak, hücreleri aktif Cre recombinase teslim bir sınırlama temsil eder.

Biz, gen-faiz doğrudan bir ekleme verir ve hızla uygun ve standart bir şekilde vektör içinde kullanılan farklı etki alanları ve etiketler clone bir platform sağlar pSESAME vektör sistemi açıklanmaktadır. Farklı etiketler yeniden düzenlenmesi, daha yüksek verim ve daha iyi çözünürlük elde etmek için bir olasılık sağlayan füzyon proteinlerin biyokimyasal özellikleri değiştirmek için gösterilmiştir. Ve E. coli hücre permeant rekombinant proteinleri ifade ve arındırmak için nasıl gösterilmektedir. Rekombinant Cre protein işlevselliğini nihayet hücre kültürü, hücre içi recombinase faaliyet değerlendirerek doğrulanır.

Protocol

Ifade vektör ve ifade İnşaat: PSESAME Cre ekspresyon vektörü standart klonlama yöntemleri kullanarak AvrII ve NheI kısıtlama siteleri aracılığıyla pSESAME bir Cre-kodlama parçası takarak inşa edilmiştir. pSESAME histidin etiketi, TAT-domain, NLS sırası ve Cre, kısaltılmış HTNCre oluşan bir füzyon proteini kodlar. HTNCre ifade için pSESAME Cre TUNER (de3) pLacI dönüştü ve bir gliserol stok hazırlamak için kullanılan. Bir gece aşırı kültür gliserol stok dönüştürdü bakteri ile kaplı bir pipetlemeyin ucunu kullanarak ekildi. % 0.5 glukoz ile desteklenmiş LB medya oluşan aşırı gece kültür [v / v] ve 50 mcg / mL nihai konsantrasyonda carbenicillin ve 37 büyümeye izin ° C de 16 saat boyunca. Ertesi gün yoğun olarak yetiştirilen üzerinde gece kültürü 1 ila 40 arasında bir oranı ifade kültürünü aşılamak için kullanılan ve 37 ° C'de bir inkübatör konuldu İfade kültürü, son bir 100 mcg / mL konsantrasyonda% 0.5 'lik glukoz [v / v] ve ampisilin ile desteklenmiş TB medya oluşuyordu. OD 595 1.5 ifade kültürü 1 saat için 0.5 mM IPTG ile indüklenen Daha sonra bakteri SLA3000 rotor 10 dakika 5000 rpm'de santrifüj yoluyla toplanmıştır. Bakteriler pelet eksi 20 ° C arıtma kadar saklandı. Hücre geçirgen protein saflaştırılması: Dondurulmuş bakteri pelet oda sıcaklığında 15 dakika başına 10 litre şişesi kültür mL lizis tamponu yeniden süspanse edildi. Süspansiyon sonra oda sıcaklığında karıştırılması sırasında, ek 15 dakika boyunca 1 mg / ml lizozim inkübe edildi. 25 U / ml Benzonase sonra eklenir ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karıştırma inkübe edildi. Gücünün% 45 0,5 darbeleri ile 1.5 dakika süreyle buz sonification sonra, 1 ml soğuk tartarik tuz tamponu (TSB) başına ml süspansiyon dikkatle süre eklendi karıştırma ve buz üzerinde 5 dakika inkübe. SDS-PAGE lizat fraksiyonu (L) örnek alındı. Temizlendi lizat ° C 'de 30 dakika 30.000 g. 4 santrifüj yoluyla elde edildi Çözünür (S) ve çözünmez fraksiyonları (I) SDS-PAGE örnekleri alındı. Süpernatant taze 50 ml şahin tüpler içine transfer oldu ve 4 az 1 saat sonra hafifçe karıştırılır ° C,% 50 Ni-NTA bulamaç ilk ifade kültür litre başına 2 ml. Süspansiyon gravite akışı EconoPac sütunu (fraksiyonu akış ile alınmıştır (FT) SDS-PAGE örnek) ile paketlenir ve 5 yatak yıkama tampon hacimleri ile iki kez yıkandı. Hem yıkama fraksiyonları (W1 ve W2) SDS-PAGE örnekleri alındı. HTNCre içeren fraksiyonlar eluat fraksiyonu (E) SDS-PAGE analizi için elüsyon tampon ve örnek 3 yatak hacimleri ile yıkandı alınmıştır. Imidazol yüksek tuz tamponu iki kez karşı elüsyon fraksiyonu diyaliz tarafından kaldırıldı. Protein solüsyonu gliserol tampon karşı iki kez diyaliz daha fazla konsantre oldu. Tüm diyaliz adımları örnek tampon oranı en az 50 oldu. Bu prosedür, 200 ve 450 mcM arasında bir normal konsantrasyonda HTNCre içeren bir gliserol stok solüsyonu ile sonuçlandı, yani 1 litre ifade kültür ~ 12 mg protein neden olacaktır. Gliserol stoku (GS) SDS-PAGE analizi için örnek toplanmıştır. HTNCre stok solüsyonu eksi 20 saklanabilir ° C Şekil 1: Cre recombinase saflaştırma işlemi sırasında toplanan örneklerin SDS-PAGE analizi. Cre ifade İndüksiyon lizat fraksiyonu egemen grup tarafından gösterilir. Çözünmeyen protein bir parçası olmakla birlikte, eluat ve gliserol stok kesirler görüldüğü gibi Cre proteini daha zenginleştirilmiş olabilir. L: Lizat: çözünmez, S: Süzüntü FT: Akış, W: Yıkama, E: Eluat, GS: Gylcerol Stok. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız . Fare embriyonik kök (ES) hücrelerin içine protein transdüksiyon: Bir koşullu β-galaktosidaz muhabiri 5 inşa taşıyan ES hücrelerinin yapışık hücrelere disosiasyon için TrypLE ™ Express kullanan tek bir hücre olarak seribaşı. 4 ila 6 saat sonra hücrelerin yeniden bağlı olan ve orta kaldırıldı. Daha sonra ES hücrelerinin, 16 saat süreyle HTNCre içeren orta inkübe edildi. Gliserol stokunun HTNCre protein uygun bir miktar (10 mcM karşılık), ES, orta ve daha sonra steril filtre (0.22 mm) içine sulandırılmış oldu. Protein transdüksiyon orta normal büyüme ortamına geri çevrildikten sonra. Iki gün hücreler PBS ile yıkanmış ve 10 dakika için% 4 Paraformaldehit (PFA) ile fikse edildi. İki ekPBS ile fonksiyonel yıkama adımları X-Gal boyama yapıldı önce idam edildi. Sabit hücreleri X-Gal boyama çözüm 6 bir tabaka ile kaplıdır ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edildi. Temsilcisi Sonuçlar: Ertesi gün X-Gal boyama çözüm talip oldu ve hücreler PBS mikroskopi analizi için bir tabaka ile kaplıydı. Recombined hücreleri 80 -% 100 β-galaktosidaz aktivitesi tarafından değerlendirilecektir fare ES hücrelerinin içinde gözlenebilmektedir.

Discussion

Cre füzyon protein saflaştırma işlemi sırasında buz TBS tampon ek santrifüj önce atlamak için önemlidir. Aksi takdirde Cre recombinase gliserol tampon içinde çökelti eğilimindedir.

Eluat fraksiyonu haline görünüyorsa çözüm yine ortadan kalkıncaya kadar, füzyon proteini ek elüsyon tampon yüksek konsantrasyonu nedeniyle bulanık eklenmelidir.

10 mcM Cre füzyon protein uygulama genellikle 80 ila% 100 arasında bir rekombinasyon verimlilik sonuçlanır. Fötal Buzağı Serumu (FCS) ES hücre ortamın önemli bir bileşeni olan, güçlü bir şekilde protein transdüksiyon inhibe eder. Cre recombinase Bu nedenle yüksek konsantrasyonda kullanılması gerekiyordu. Serum serbest koşullarda çalışırken daha az protein (0.5 – 2 mcM) benzer rekombinasyon verimliliği elde etmek için kullanılabilir.

Eldeki pSESAME vektör sistemi ile bir Oct4 ve Sox2 ⁷ ve Scl/Tal1 ⁸ gibi transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere diğer proteinler protein iletimi tekniği uygulayabilirsiniz.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
TUNER (DE3) pLacI		Novagen	70625
Glycerol		Carl Roth	3783.2
Na2HPO4		Roth	T876.1
Trizma Base		Sigma-Aldrich	T1503
HCl		Roth	4625.1
Imidazol		Roth	X998.4
NaCl		Roth	9265.2
Yeast Extract		Roth	2363.4
Trypton/Pepton		Roth	8952.4
K2HPO4		Roth	P749.2
KH2PO4		Roth	3904.1
Ampicillin		Sigma	A9518
Carbenicillin		Sigma	6344.2
HEPES		Sigma	H3375
Lysozyme		Sigma	62971
Benzonase		Novagen
L-Tartaric acid, disodium salt		Sigma
50% Ni-NTA slurry		Invitrogen	R901-15
EconoPac columns		Biorad	732-1010
Sterile filter 0,22μm		Whatman
Paraformaldehyde (PFA)		Sigma
LB medium				Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl
TB medium				Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4
Lysis Buffer				50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8
Tartaric Salt Buffer (TSB)				PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol
Washing Buffer				PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol
Elution Buffer				PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol
High Salt Buffer				600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
Gylcerol Buffer				50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
TrypLE™ Express		Invitrogen
ESGRO (LIF)		Millipore
NEAA		Gibco	11140035
L-Glutamin		Gibco	25030024
β-Mercaptoethanol		Gibco	31350010
DMEM		Gibco	11960044
PBS		Gibco
Fetal Calf Serum (FCS)		PAA
X-Gal staining solution:				4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS
K3(FeIII(CN)6)		Sigma	P-3367
K4 (FeII(CN)6)		Sigma	P-9387
MgCl2		Sigma	M8266
X-Gal		Sigma	B4252