Ce protocole illustre comment la tension colorants sensibles pour permettre l'enregistrement optique de l'activité électrique de réseaux de neurones intacts tels que les réseaux de la Guinée-cochon système nerveux entérique, avec une résolution réglable allant de simples cellules à multi-ganglionnaires circuits.
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Article de méthode
Enregistrement optique de l'activité électrique en Guinée-cochon Réseaux entérique en utilisant la tension colorants sensibles
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le système nerveux entérique (ENS) est un réseau autonome avec fonctions identifiées, capable de réaliser des comportements complexes dans l'isolement. Ses neurones (10 à 25 um de diamètre) sont disposées en plexus qui se limitent à des plans distincts de la paroi intestinale
Protocole
Partie 1: Préparation des tissus
- Les préparatifs sous-muqueux et plexus myentérique sont isolées par la dissection séquentielle de l'intestin grêle de 150-200g (2-3 semaines) Hartley porcs Guinée qui ont été anesthésiés par inhalation d'isoflurane et décapité. Après l'euthanasie, l'intestin grêle est excisée et son contenu retiré en rinçant la lumière avec une ambiance chaleureuse, solution oxygénée. Nous utilisons Milieu 199 complété avec 25 mM HEPES, 5 mM NaHCO 3 et 2 mM de glutamine, et le pH ajusté à 7,4 (appelé, à partir de maintenant, comme M199-MS), qui a été préchauffé à 37 ° C. Toutes les étapes restantes du protocole, c....
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Discussion
Ce protocole a été écrit avec deux objectifs en tête. Le premier est de convaincre d'autres chercheurs qui, grâce à des nombreux progrès technologiques de la dernière décennie, l'enregistrement optique de l'activité électrique en utilisant la tension colorants sensibles est devenu l'un des plus puissants, des méthodologies fiables et abordables pour étudier les réseaux neuronaux intacts; effet , il pourrait être facilement mis en œuvre, même dans un laboratoire disposant de ressources modestes. Le deuxiè.......
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Remerciements
Nous tenons à remercier DA Coulter (CHOP) pour nous avoir permis d'utiliser ses deux photons microscope pour acquérir les images 2-photons montré au début de la vidéo, et H. Takano pour le partage avec nous son expertise technique.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Milieu 199 | Sigma-Aldrich | M3769 | Avec sels d'Earle’s, sans L-glutamine, rouge de phénol et bicarbonate de sodium |
| Sylgard | Dow Corning | Kit d'élastomère de silicone 184 | |
| Épingles pour insectes utilisées pour la dissection | F.S.T. | 26001-30 | |
| Pinces Dumont | F.S.T. | 11203-23 ou 11200-33 | |
| Ciseaux à ressort Moria MC19/B Pascheff-Wolff | F.S.T. | 15371-92 | |
| Épingles pour maintenir le tissu pendant l'expérience | Seirin Corp. | Seirin Spinex | |
| Collagénase VII | Sigma-Aldrich | C0773 | |
| Protéase IX | Sigma-Aldrich | P6141 | |
| Sérum de veau fœtal | Invitrogen | 10439-016 | |
| PenStrep | GIBCO, par Life Technologies | 15140 | |
| L-Glutamine 100X | GIBCO, par Life Technologies | 25030 | |
| Nifédipine | Sigma-Aldrich | ||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Life Technologies | D36802 | |
| Générateur de stimulus à 4 canaux | Multi Channel System MCS GmbH | Série 2000 | |
| Pompe péristaltique | Rainin | Dinamax RP-1 à 2 canaux | |
| Caméra haute vitesse | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| Démagnificateur 1:10 / lentille de relais | Optem, Qioptiq Inc. | ||
| Microscope droit | Olympus Corporation | BX61TRF | |
| Scène fixe Gibraltar avec translateur X-Y motorisé | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Québec, Canada | PSSG--BX2 | |
| Électrodes matricielles linéaires | FHC, Inc. | Sur mesure | |
| Table d'isolation active des vibrations | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | |
| Alimentation stabilisée à rétroaction ultra-basse ondulation | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | |
| Filtre thermique | Schott AG | KG-1 | |
| Filtre d'interférence à haute qualité | Chroma Inc. | HQ530/50 | |
| Miroir dichroïque | Chroma Inc. | 565 nm (transmission à 50 %) | |
| Filtre passe-haut | Chroma Inc. | HQ572LP | |
| Rideaux acoustiques | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | |
| Neuroplex | RedShirtImaging, LLC | ||
| IDL | ITT Visual Information Solutions | ||
| Caméra CCD haute résolution, avec son propre contrôleur de caméra | Hamamatsu Corp. | ||
| Capturateur d'images pour caméra haute résolution | Data Translation | DT3120K-1 | |
| Logiciel d'imagerie pour caméra haute résolution | Data Translation | Global Lab Image/2 |
Références
- Johnson, L. eonard R. in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell....
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Réimpressions et autorisations
