هذا البروتوكول يوضح كيفية الجهد الحساسة الأصباغ البصرية للتمكن من تسجيل النشاط الكهربائي من الشبكات العصبية سليمة مثل الضفائر للنظام العصبي الخنازير الغينية المعوية ، مع قرار تعديل والتي تتراوح من واحد الى خلايا متعددة الدوائر العقدية.
النظام العصبي المعوي (ENS) هو عبارة عن شبكة قائمة بذاتها مع المهام المحددة ، وقادرة على أداء السلوك المعقد في عزلة. يتم ترتيب الخلايا العصبية والخمسين (10-25 ميكرون في القطر) في الضفائر التي تقتصر على طائرات متميزة من جدار المعي<sup> 1</sup> ، ويمكن العثور على الضفيرة العضلية المعوية بين طبقات العضلات الطولية والدائري ، والضفيرة تحت المخاطية بين طبقة العضلات الدائرية والغشاء المخاطي لل. منذ أنظمة المستجيب لهذه الضفائر (نقل ظهارة ، وخلايا الغدد الصماء ، وعناصر المناعة والأوعية الدموية والعضلات الملساء) وترد أيضا ضمن جدار الامعاء ، ويمكن تشريح شبه سليمة الاستعدادات التي تحفظ المكونات الفردية للمنعكس مسارات مختلفة. يتم التحكم في سلوك النظم المستجيب من الضفائر تحت المخاطية والعضلية المعوية التي تعمل بانسجام. لذلك ، معرفة مفصلة من التفاعلات داخل ومتشابك بين العقد ، والتواصل بين الضفائر ، أمر ضروري لفهم وظيفة الجهاز الهضمي الطبيعي. وENS ، ونظام العصبي سليمة ، هو نموذج فريد التجريبية التي يمكن للمرء أن ربط الأحداث الجزيئية والخلوية مع سلوك الكهربائية من الشبكة العصبية الفسيولوجية ومخرجاته. لأن للمنظمة شبه ثنائية الأبعاد من الضفائر والخمسين ، وبشكل خاص يناسب ENS لدراسة الشبكات العصبية باستخدام تقنيات متعددة موقع تسجيل البصرية التي تستخدم الجهد الحساسة الأصباغ<sup> 2،7،8،9</sup>. وسوف نوضح هنا استخدام جديد نسبيا naphthylstyryl – pyridinium صبغ (دى ANEPPDHQ – 4)<sup> 3</sup> هو الذي يوفر مزايا عدة على سابقاتها ، بما في ذلك الضيائية منخفضة جدا ، وبطء الاستيعاب ، والاستقرار الملحوظ الكيميائية. عندما تستخدم بالاقتران مع الكاميرا التي تسمح الفرعي ملي وقت القرار ، وصبغ هذا يسمح لنا لرصد النشاط الكهربائي للخلايا العصبية في كل مجال الرؤية للقرار مكانية القصوى من 2.5 ميكرومتر ~ في التكبير 100X. في أقل التكبير (10X أو 20X) ، يتم تعويض تضحية وحيدة الخلية القرار مكسبا في وجهات النظر ، وكشف عن تعقيدات الدوائر بين العقدية.
لقد كتب هذا البروتوكول مع هدفين في الذهن. أول واحد هو إقناع المحققين أخرى ، وذلك بفضل التقدم التكنولوجي كثير من العقد الماضي ، مسجلا البصرية النشاط الكهربائي باستخدام الأصباغ الحساسة الجهد قد تصبح واحدة من المنهجيات ، وأقوى موثوقة وبأسعار معقولة لدراسة الشبكات العص…
نود أن نشكر DA كولتر (ختم) على إتاحة الفرصة لنا لاستخدام له 2 الفوتون المجهر للحصول على صور 2 – الفوتون أظهرت في بداية الفيديو ، وتاكانو حاء لتقاسم معنا خبرته الفنية.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Medium 199 | Sigma, St. Louis, MO | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate | |
Sylgard | Dow Corning Corp., Midland, MI | 184 silicone elastomer kit | ||
Insect pins used for dissection | F.S.T., Foster City, CA | 26001-30 | ||
Dumont forceps | F.S.T., Foster City, CA | 11203-23 or 11200-33 | ||
Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T., Foster City, CA | 15371-92 | ||
Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp., Shizuoka, Japan | Seirin Spinex | ||
Collagenase VII | Sigma, St. Louis, MO | C0773 | ||
Protease IX | Sigma, St. Louis, MO | P6141 | ||
Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Carlsbad, CA | 10439-016 | ||
PenStrep | GIBCO, BRL | 15140 | ||
L-Glutamine 100X | GIBCO, BRL | 25030 | ||
Nifedipine | Sigma, St. Louis, MO | |||
Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Eugene, OR | D36802 | ||
4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH, Reutlingen, Germany | 2000 Series | ||
Peristaltic pump | Rainin, Woburn, MA | 2-channel Dinamax RP-1 | ||
High-speed camera | RedShirtImaging, LLC Decatur, GA | NeuroCCD-SM | ||
1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Linos, Inc., Rochester, NY | |||
Upright microscope | Olympus Optical Co., Tokyo, Japan | BX61TRF | ||
Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG–BX2 | ||
Linear matrix electrodes | FHC, Inc., Bowdoin, ME | Custom made | ||
Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | ||
Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | ||
Heat filter | Schott Optical Glass, Duryea, PA | KG-1 | ||
High-Q interference filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ530/50 | ||
Dichroic mirror | Chroma, Inc., Rockingham, VT | 565 nm (50% transmission) | ||
Long-pass filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ572LP | ||
Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | ||
Neuroplex | RedShirtImaging, Inc., Decatur, GA | |||
IDL | ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO | |||
High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Photonics, KK, Hamamatsu City, Japan | |||
Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | DT3120K-1 | ||
Imaging software for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | Global Lab Image/2 |