Het meten van diffusiecoëfficiënten via twee-foton Fluorescence Recovery After Photobleaching
Summary
In dit artikel beschrijven we de procedure voor het meten van diffusiecoëfficiënten het gebruik van multi-foton fluorescentie herstel na fotobleken. We zullen beginnen met het uitlijnen van de laser langs de optische pad naar het monster en het bepalen van de juiste experimentele parameters, ga dan verder het genereren en tenslotte montage fluorescentie herstel curves.
Abstract
Multi-fluorescentie herstel na fotobleken is een microscopie techniek die gebruikt wordt om de diffusiecoëfficiënt (of analoge transport parameters) van macromoleculen te meten, en kan worden toegepast op zowel<em> In vitro</em> En<em> In vivo</em> Biologische systemen. Multi-fluorescentie herstel na fotobleken wordt uitgevoerd door fotobleken een gebied van belang in een tl-monster met behulp van een intense laser flash, dan is het verminderen van de balk en het toezicht op de fluorescentie als nog-fluorescerende moleculen van buiten de regio van belang diffuse in de photobleached moleculen te vervangen . We beginnen onze demonstratie door het uitlijnen van de laserstraal door de Pockels Cell (laser modulator) en langs de optische pad door de laser scan-box en objectief naar het monster. Voor de eenvoud zullen we gebruik maken van een steekproef van waterige fluorescente kleurstof. Wij zullen dan bepalen de juiste experimentele parameters voor onze steekproef met inbegrip van, monitoren en bleken bevoegdheden, bleekmiddel duur, bak breedte (voor foton tellen), en fluorescentie hersteltijd. Vervolgens beschrijven we de procedure voor het nemen van herstel bochten, een proces dat grotendeels kan via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) geautomatiseerde voor een betere doorvoer. Ten slotte wordt de diffusie coëfficiënt bepaald door het aanbrengen van het herstel van gegevens aan de juiste wiskundig model met behulp van een kleinste-kwadraten fitting algoritme, gemakkelijk te programmeren met behulp van software zoals MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).
Protocol
Discussion
De kracht van multi-foton fluorescentie herstel na fotobleken ligt in zijn vermogen om dikke stalen sonde met 3D-resolutie. Sinds de ontwikkeling in de jaren 1990, heeft MP-FRAP is gebruikt om de diffusiecoëfficiënt (of analoge transport parameters) te bepalen in cellichamen, ex vivo dikke plakken weefsel, en in vivo weefsel en interstitium. In dit artikel presenteerden wij de apparatuur die nodig is om een MP-FRAP experiment, evenals de juiste procedure voor het uitlijnen van de stralengang ru…
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door het Ministerie van Defensie Era of Hope Scholar Award (No. W81XWH-05-0396) en een Pew Scholar in de Biomedische Wetenschappen Award uit aan Edward B. Brown III.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ti:sapphire laser | Spectra Physics | Mai Tai | ||
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | ||
| Laser Scanning Microscope | Olympus | Fluoview | ||
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technologies | 670 DCSX-2P | ||
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | ||
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | ||
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | ||
| FITC-BSA | Invitrogen | — |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. r. o. w. n., Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
