Misurare coefficienti di diffusione via a due fotoni di recupero fluorescenza Dopo photobleaching
Summary
In questo articolo andremo a descrivere il procedimento per determinare coefficienti di diffusione multi-fotone con il recupero di fluorescenza dopo photobleaching. Inizieremo allineando il laser lungo il percorso ottico al campione e determinare i parametri corretti sperimentale, poi continuare a generare ed infine montaggio curve recupero fluorescenza.
Abstract
Multi-fluorescenza recupero dopo photobleaching è una tecnica di microscopia utilizzato per misurare il coefficiente di diffusione (o parametri di trasporto analoghe) delle macromolecole, e può essere applicato sia<em> In vitro</em> E<em> In vivo</em> Sistemi biologici. Multi-fluorescenza recupero dopo photobleaching viene eseguito da photobleaching una regione di interesse all'interno di un campione fluorescente con un flash intenso laser, poi attenuare il fascio e il monitoraggio della fluorescenza come ancora molecole fluorescenti al di fuori della regione di diffuso interesse per sostituire le molecole fotodecolorate . Inizieremo la nostra dimostrazione, allineando il raggio laser attraverso il cellulare Pockels (modulatore laser) e lungo il cammino ottico attraverso la finestra di scansione laser e lenti dell'obiettivo al campione. Per semplicità, useremo un campione di acquoso colorante fluorescente. Ci sarà quindi determinare i parametri corretti sperimentale per il nostro campione compreso, monitorare e poteri candeggio, durata candeggina, larghezze bin (per il conteggio di fotoni), e tempi di recupero di fluorescenza. Successivamente, verranno descritti la procedura di prelievo curve di recupero, un processo che può essere in gran parte automatizzato tramite LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) per un throughput maggiore. Infine, il coefficiente di diffusione è determinato dal montaggio del recupero dei dati al modello matematico appropriato utilizzando un algoritmo dei minimi quadrati montaggio, facilmente programmabile tramite un software come MATLAB (The MathWorks, Natick, MA).
Protocol
Discussion
La potenza del multi-fotone recupero di fluorescenza dopo photobleaching risiede nella sua capacità di sondare i campioni di spessore con risoluzione 3D. Dal momento che il suo sviluppo nel 1990, MP-FRAP è stato utilizzato per determinare il coefficiente di diffusione (o parametri di trasporto analoghe) in corpi cellulari, ex fette di tessuto vivo di spessore, e nel tessuto vivo e nell'interstizio. In questo articolo, abbiamo presentato l'attrezzatura necessaria per eseguire…
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da un Dipartimento di Era Difesa del Premio Speranza Scholar (n. W81XWH-05-0396) e un Scholar Pew al Premio Scienze Biomediche a Edward B. Brown III.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ti:sapphire laser | Spectra Physics | Mai Tai | ||
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | ||
| Laser Scanning Microscope | Olympus | Fluoview | ||
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technologies | 670 DCSX-2P | ||
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | ||
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | ||
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | ||
| FITC-BSA | Invitrogen | — |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. r. o. w. n., Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
