Medición de los coeficientes de difusión a través de dos fotones de fluorescencia de recuperación después de photobleaching
Summary
En este artículo vamos a describir el procedimiento para medir coeficientes de difusión con multi-fotón recuperación de fluorescencia después de photobleaching. Vamos a empezar por alinear el láser a lo largo del camino óptico de la muestra y la determinación de los parámetros experimentales adecuadas, y luego continuar la generación de curvas de fluorescencia y por último montaje de recuperación.
Abstract
Multi-fluorescencia de recuperación después de photobleaching es una técnica de microscopía para medir el coeficiente de difusión (o parámetros análogos de transporte) de las macromoléculas, y se puede aplicar tanto a<em> In vitro</em> Y<em> In vivo</em> Los sistemas biológicos. Multi-fluorescencia de recuperación después de photobleaching se lleva a cabo por photobleaching una región de interés dentro de una muestra fluorescente se utiliza un flash láser intensa, atenuar el haz y el control de la fluorescencia de las moléculas fluorescentes que aún fuera de la región de difusión de interés para reemplazar a las moléculas photobleached . Vamos a empezar nuestra demostración, alineando el haz de láser a través de la célula Pockels (modulador láser) ya lo largo del camino óptico a través del cuadro de escaneo láser y la lente de objetivo de la muestra. Para simplificar, vamos a utilizar una muestra de tinte fluorescente acuoso. A continuación, se determinan los parámetros adecuados para nuestra muestra experimental, incluyendo el seguimiento y los poderes de blanqueo, la duración de la lejía, anchos de caja (de conteo de fotones), y el tiempo de recuperación de fluorescencia. A continuación, se describe el procedimiento para la toma de curvas de recuperación, un proceso que se puede automatizar en gran medida a través de LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) para un rendimiento mejorado. Finalmente, el coeficiente de difusión es determinado por la instalación de recuperación de datos para el modelo matemático adecuado utilizar un algoritmo de ajuste por mínimos cuadrados, fácilmente programable utilizando software como MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).
Protocol
Discussion
El poder de la multi-fotón recuperación de fluorescencia después de photobleaching radica en su capacidad de conseguir que las muestras de espesor con una resolución en 3D. Desde su desarrollo en la década de 1990, MP-FRAP se ha utilizado para determinar el coeficiente de difusión (o parámetros análogos de transporte) en los cuerpos celulares, ex rebanadas gruesas de tejido vivo, y en el tejido vivo y el intersticio. En este artículo, presentamos el equipo necesario para real…
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Departamento de Defensa de la concesión era de esperanza Scholar (N º W81XWH-05-0396) y una beca Pew en el Premio de Ciencias Biomédicas de Edward B. Brown III.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ti:sapphire laser | Spectra Physics | Mai Tai | ||
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | ||
| Laser Scanning Microscope | Olympus | Fluoview | ||
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technologies | 670 DCSX-2P | ||
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | ||
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | ||
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | ||
| FITC-BSA | Invitrogen | — |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. r. o. w. n., Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
