Dans cet article nous allons décrire la procédure de mesure de coefficients de diffusion multi-photons en utilisant la récupération de fluorescence après photoblanchiment. Nous allons commencer par aligner le laser le long du chemin optique à l'échantillon et la détermination des paramètres expérimentaux appropriés, puis continuer à générer et enfin l'ajustement de courbes de recouvrement de fluorescence.
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Article de méthode
Mesure des coefficients de diffusion par deux photons de récupération de fluorescence après photoblanchiment
Dans cet article
Résumé
Résumé
Multi-fluorescence après photoblanchiment de récupération est une technique de microscopie utilisée pour mesurer le coefficient de diffusion (ou les paramètres de transport analogues) des macromolécules, et peut être appliqué à la fois
Protocole
1. Aligner le système optique.
L'équipement clé pour une expérience MP-FRAP comprennent: un mode bloqué source laser, cellule de Pockels (pour le faisceau de modulation), générateur d'impulsions, dichroïques, objectif, émission de fluorescence du filtre, tube photomultiplicateur fermée, et un système d'enregistrement des données (photon contre et multicanaux scaler).
2. Déterminer les pouvoirs de surveiller en toute sécurité.
- Atténuer le laser à un faible, mais raisonnable, le pouvoir de générer la fluorescence dans l'échantillon.
- Concentrer au sein de l'échantillon.
- Définissez un ....
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Discussion
La puissance du multi-photons de recouvrement de fluorescence après photoblanchiment réside dans sa capacité à sonder des échantillons épais avec une résolution 3D. Depuis son développement dans les années 1990, MP-FRAP a été utilisée pour déterminer le coefficient de diffusion (ou les paramètres de transport analogue) dans les corps cellulaires, ex vivo des tissus tranches épaisses, et dans les tissus in vivo et l'interstitium. Dans cet article, nous avons présenté l'équipement nécess.......
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Remerciements
Ce travail a été financé par un ministère de la Défense de l'ère Scholar Award Espoir (n ° W81XWH-05-0396) et chercheur au Pew le Prix des sciences biomédicales à Edward B. III Brown.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Laser Ti:saphir | Newport Corp. | Mai Tai | |
| Cellule de Pockels | Conoptics | 350-80 | |
| Microscope à balayage laser | Olympus Corporation | Fluoview | |
| Miroir dichroïque passe-bas | Chroma Technology Corp. | 670 DCSX-2P | |
| Photomultiplicateur | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Compteur de photons | Stanford Research Systems | SR 400 | |
| Scalateur/moyenneur multicanal | Stanford Research Systems | SR 430 | |
| Générateur d'impulsions | Stanford Research Systems | DG 535 | |
| FITC-BSA | Invitrogen | -- |
Références
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.
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Réimpressions et autorisations
