Live-dissectie van Drosophila Embryo's: Gestroomlijnde methoden voor het screenen Mutant Collections door antilichaam kleuring
Summary
We beschrijven een gestroomlijnde protocol voor het genereren van "filet" bereidingen van Drosophila embryo's van bepaalde genotypen. Dit protocol maakt een efficiënte uitvoering van een variëteit van genetische screens. Het maakt ook een uitstekende visualisatie van structuren in de late embryo.
Abstract
Drosophila embryo's tussen de etappes 14 en 17 van de embryonale ontwikkeling kan gemakkelijk worden ontleed om "filet" preparaten te genereren. In deze voorbereidingen, het centrale zenuwstelsel loopt in het midden, en wordt geflankeerd door het lichaam muren. Veel verschillende fenotypes zijn onderzocht met behulp van een dergelijke preparaten. In de meeste gevallen werden de filets gegenereerd door ontleding van antilichaam-gekleurde vaste hele-mount embryo's. Deze "vaste dissecties" hebben een aantal nadelen, echter. Ze zijn tijdrovend uit te voeren, en het is moeilijk om mutant (GFP-negatief) embryo's sorteren van voorraden waarin mutaties in de loop der GFP balancer chromosomen. Sinds 2002 is onze groep is het uitvoeren van een tekort en ectopische expressie schermen om liganden voor weesreceptoren te identificeren. Om dit te doen, we ontwikkelden gestroomlijnde protocollen voor de live-embryo dissectie en antilichaam kleuring van collecties met honderden gebalanceerde lijnen. We hebben geconcludeerd dat het aanzienlijk efficiënter om fenotypes in grote collecties van de voorraden te onderzoeken door live dissectie dan door vaste dissectie. Met behulp van het protocol hier beschreven, kan een enkel individu opgeleid tot het scherm tot 10 lijnen per dag voor fenotypes, onderzoek 4-7 mutant embryo's van elke regel onder een samengestelde microscoop. Dit maakt de identificatie van mutaties die een subtiele, lage penetrantie fenotypes, omdat tot 70 hemisegments per lijn worden gescoord bij een sterke vergroting met een 40X water-immersie lens.
Protocol
Discussion
We hopen dat deze video demonstratie heeft onze methoden weergegeven voor live-embryo dissectie en kleuring in voldoende detail dat ze nu gemakkelijk kan worden uitgevoerd door een persoon die enige ervaring heeft in Drosophila genetica en embryologie. Natuurlijk zullen veel praktijk nog steeds nodig zijn, vooral voor de dissecties zelf. In onze ervaring, zal iedere persoon die leert de live-dissectie methoden creëren een subtiel ander dissectie protocol waarmee hij / zij het snelst het genereren van hoge kwal…
Acknowledgements
Wij danken Nicki Fox en Aloisia Schmid voor hun bijdragen aan ontwikkeling van deze protocollen. Dit werk werd ondersteund door een NIH RO1 te verlenen aan KZ, NS28182.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Borosilicate Tubing With Filament | Sutter Instrument | BF120-60-10 | ||
| Narishige model PC-10 needle puller | Narishige | Tubes pulled using a heater level of 58.9 |
References
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo. Cell. 84, 599-609 (1996).
- Sun, Q., Schindelholz, B., Knirr, M., Schmid, A., Zinn, K. Complex genetic interactions among four receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance in Drosophila. Molecular and cellular neurosciences. 17, 274-291 (2001).
- Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila. Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).
- Fox, A. N., Zinn, K. The heparan sulfate proteoglycan syndecan is an in vivo ligand for the Drosophila LAR receptor tyrosine phosphatase. Curr Biol. 15, 1701-1711 (2005).
