Live dissekering av Drosophila Embryon: Effektivare metoder för screening Mutant Samlingar av Antibody färgning
Summary
Vi beskriver en strömlinjeformad protokoll för att generera "filé" beredningar av Drosophila embryon av vissa genotyper. Detta protokoll möjliggör effektivt genomförande av olika genetiska skärmar. Det gör också utmärkt visualisering av strukturer i det sena embryot.
Abstract
Drosophila embryon mellan stegen 14 och 17 i embryot kan lätt dissekeras för att generera "filé" förberedelser. I dessa förberedelser driver det centrala nervsystemet i mitten, och flankeras av kroppen väggarna. Många olika fenotyper har undersökts med hjälp av sådana preparat. I de flesta fall var de filéer som genereras av dissekering av antikropps-färgade fast hel-fäste embryon. Dessa "fasta dissektioner" har vissa nackdelar, dock. De är tidskrävande att utföra, och det är svårt att sortera mutant (GFP-negativa) embryon från bestånd där mutationer förs över GFP balansblock kromosomer. Sedan 2002 har vår grupp utfört brist och ektopiska skärmar uttryck för att identifiera ligander för föräldralösa receptorer. För att göra detta har vi utvecklat strömlinjeformad protokoll för levande embryo dissekering och antikroppar färgning av samlingar innehåller hundratals balanserade linjer. Vi har dragit slutsatsen att det är betydligt mer effektivt att undersöka fenotyper i stora samlingar av bestånd lever dissektion än av fasta dissekering. Använder protokollet som beskrivs här, kan en enda utbildad individuell skärm upp till 10 rader per dag för fenotyper, granska 4-7 mutant embryon från varje rad i ett sammansatt mikroskop. Detta möjliggör identifiering av mutationer som ger subtila, låg penetrans fenotyper, eftersom upp till 70 hemisegments per linje är brända i hög förstoring med ett 40X vatten nedsänkning lins.
Protocol
Discussion
Vi hoppas att denna video demonstration har visat våra metoder för live embryo dissekering och färgning tillräckligt detaljerade att de nu kan lätt utföras av en person som har viss erfarenhet av Drosophila genetik och embryologi. Naturligtvis kommer betydande praktiken fortfarande att krävas, främst för dissektioner själva. Vår erfarenhet är att varje person som lär sig leva dissekeringsmetoder skapa ett subtilt annorlunda dissektion protokoll som gör honom / henne att snabbast generera hög kval…
Acknowledgements
Vi tackar Nicki Fox och Aloisia Schmid för deras bidrag till utvecklingen av dessa protokoll. Detta arbete stöddes av en NIH RO1 bidrag till KZ, NS28182.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Borosilicate Tubing With Filament | Sutter Instrument | BF120-60-10 | ||
| Narishige model PC-10 needle puller | Narishige | Tubes pulled using a heater level of 58.9 |
References
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo. Cell. 84, 599-609 (1996).
- Sun, Q., Schindelholz, B., Knirr, M., Schmid, A., Zinn, K. Complex genetic interactions among four receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance in Drosophila. Molecular and cellular neurosciences. 17, 274-291 (2001).
- Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila. Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).
- Fox, A. N., Zinn, K. The heparan sulfate proteoglycan syndecan is an in vivo ligand for the Drosophila LAR receptor tyrosine phosphatase. Curr Biol. 15, 1701-1711 (2005).
