जीन Pulser MXcell electroporation प्रणाली का उपयोग करने के लिए उच्च क्षमता के साथ प्राथमिक कोशिकाओं transfect

Summary

इस प्रक्रिया से पता चलता है कि किस तरह जीन Pulser MXcell electroporation प्रणाली का उपयोग करने के लिए तेजी से और आसानी से माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts या अन्य प्राथमिक कोशिकाओं के लिए सबसे अच्छा electroporation शर्तों की पहचान है. समस्या निवारण के लिए विचारणीय बातें भी जुड़े वीडियो में चर्चा कर रहे हैं.

Abstract

यह तेजी से स्पष्ट होता जा रहा है कि electroporation प्राथमिक कोशिकाओं में डीएनए प्लाज्मिड या siRNA परिचय का सबसे प्रभावी तरीका है. जीन Pulser MXcell electroporation प्रणाली और जीन Pulser electroporation बफर (जैव रेड) विशेष रूप से आसानी से स्तनधारी कोशिकाओं और प्राथमिक और स्टेम कोशिकाओं के रूप में मुश्किल – transfect कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड transfect करने के लिए विकसित किए गए. हम प्रदर्शन करेंगे कैसे प्रदर्शन करने के लिए एक सरल प्रयोग करने के लिए जल्दी से सर्वोत्तम electroporation शर्तों पहचान. हम कैसे इतना है कि एक प्रयोग के अनुकूलन के रूप में किया जाता है एक ही समय पर आयोजित किया जा सकता electroporation स्थितियों की एक श्रृंखला के माध्यम से कई नमूने को चलाने के लिए प्रदर्शन करेंगे. हम भी दिखा कैसे इष्टतम स्थितियों 96 अच्छी तरह से electroporation प्लेटों का उपयोग पहचान मानक electroporation cuvettes के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, electroporation cuvettes electroporation प्लेटों से स्विच की सुविधा जबकि एक ही electroporation क्षमता को बनाए रखने जाएगा. वीडियो में, हम भी महत्वपूर्ण कारक है कि electroporation प्रयोगों की सफलता या विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं यह कुछ चर्चा करेंगे.

Protocol

1) सेल तैयारी जब पक्षपाती कोशिकाओं का उपयोग, यह trypsinize और पहले कोशिकाओं electroporation के लिए इकट्ठा करने के लिए आवश्यक है. चार माउस भ्रूणीय fibroblast (MEF) संस्कृतियों, तीन अलग बीतने संख्या का प्रतिनिधित्व के बीच अभिकर्मक तुलना करने के लिए, प्रत्येक फ्लास्क पर निम्नलिखित प्रदर्शन. बंद सेल संस्कृति मीडिया Aspirate. पीबीएस जोड़ें करने के लिए कोशिकाओं धोने. पीबीएस निकालें, पर्याप्त trypsin जोड़ने के लिए कोशिकाओं को कवर, और कुछ मिनट प्रतीक्षा करने के लिए trypsin कोशिकाओं अलग करने की अनुमति. कक्षों की हालत को सत्यापित करने के लिए एक खुर्दबीन के साथ बोतल की जाँच करें, फ्लास्क एक प्रकार का जहाज़ के लिए कोशिकाओं को अलग, और उसके बाद फ्लास्क फिर से जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं सब अलग हैं. अतिरिक्त समय और यदि आवश्यक दोहराने रुको. एक बार सभी कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, सीरम युक्त मीडिया को जोड़ने के लिए trypsin बेअसर. एक अपकेंद्रित्र ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण, और centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं (आरसीएफ = 300 XG). पीबीएस के एक ज्ञात मात्रा में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें. कोशिकाओं की गणना. सेल निलंबन का उचित मात्रा प्रयोगों के लिए कोशिकाओं (आप 1 10 6 कोशिकाओं एक्स / एमएल के एक घनत्व पर अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं की 150 μL की आवश्यकता होगी) की अपेक्षित संख्या प्रदान करने के लिए एक नया ट्यूब पर स्थानांतरण. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं. जीन Pulser electroporation 1 10 6 कोशिकाओं / एमएल एक्स के एक सेल घनत्व को प्राप्त करने के लिए बफर का उचित मात्रा में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें. सेल निलंबन के प्लाज्मिड प्रति एमएल के 20 μg जोड़ें और धीरे मिश्रण. 2) electroporation पोत सेटअप और electroporation प्लेट सेटअप और electroporation जीन Pulser MXcell electroporation प्रणाली की शक्ति मॉड्यूल में प्लग प्लेट चैम्बर. पिपेट 150 μL सेल मिश्रण या एक 96 अच्छी तरह electroporation थाली के कुओं में बफर. प्लेट चैम्बर और नाड़ी में थाली रखो. चैम्बर से थाली निकालें. प्रत्येक कुएं में ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से सामग्री का मिश्रण. प्रत्येक अच्छी तरह से 12 अच्छी तरह प्लेटें में पूर्व गर्म बफर कोशिकाओं स्थानांतरण. थाली ठोकर कोशिकाओं को वितरित करने और इसे इनक्यूबेटर में डाल दिया. कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए ठीक. क्युवेट सेटअप और electroporation जीन Pulser MXcell electroporation प्रणाली और ShockPod में प्लग ™ क्युवेट कक्ष की शक्ति मॉड्यूल से प्लेट चैम्बर हाल चलाना. पिपेट सेल निलंबन के एक 0.4 सेमी अंतराल electroporation क्युवेट में 600 μL. ShockPod कक्ष में क्युवेट रखो और बिजली की नाड़ी देने. कक्ष से क्युवेट निकालें. क्युवेट में ऊपर और नीचे pipetting द्वारा क्युवेट सामग्री का मिश्रण. प्रत्येक अच्छी तरह से 12 अच्छी तरह प्लेटें में पूर्व गर्म बफर कोशिकाओं स्थानांतरण. थाली ठोकर कोशिकाओं को वितरित करने और इसे इनक्यूबेटर में डाल दिया. कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए ठीक. 3) प्रतिनिधि परिणाम Transfecting कोशिकाओं और उन्हें ठीक करने के लिए अनुमति देता है के बाद, अभिकर्मक दक्षता गुणात्मक विश्लेषण, epifluorescent माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर, और मात्रात्मक प्रवाह cytometry का उपयोग. चित्रा 1 कोशिकाओं है कि सफलतापूर्वक किया गया electroporated है और अब GFP जीन व्यक्त epifluorescent माइक्रोस्कोपी के तहत दिखाई देते हैं. चित्रा 2 चरण विपरीत तहत कोशिकाओं देखना. दोनों ट्रांसफ़ेक्ट और untransfected कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देता है. इन कोशिकाओं है कि 200V पर सबसे कम वोल्टेज electroporation नाड़ी से अवगत कराया गया कर रहे हैं. कोशिकाओं को मोटे तौर पर उच्च घनत्व सेल कारण मिला हुआ हैं. चित्रा 3. Epifluorescence के तहत देखने के समान फ़ील्ड कोशिकाओं GFP मार्कर व्यक्त कर रहे हैं की एक संख्या से पता चलता है, लेकिन इन पिछले छवि में दिखाई कोशिकाओं के केवल एक छोटा प्रतिशत कर रहे हैं. चित्रा 4 250V में जीवित कोशिकाओं की कुल संख्या चरण विपरीत के तहत देखा थोड़ा कम हो जाती है . चित्रा 5 के तहत epifluorescence, एक देख सकते हैं कि GFP व्यक्त कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई है. उच्चतम वोल्टेज 6 चित्रा. लागू, 375V, वहाँ कम रहते दिखाई कोशिकाओं रहे हैं. 7 चित्रा हालांकि, शेष कोशिकाओं का एक बड़ा प्रतिशत GFP व्यक्त कर रहे हैं. कौन सा हालत इष्टतम है प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है. कुछ प्रयोगों में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की संख्या सबसे इष्टतम हो सकता है, अन्य प्रयोगों में सर्वोच्च प्रतिशत अभिकर्मक सबसे अच्छा हो सकता है हो सकता है. हम कोशिकाओं है कि प्रत्येक शर्त के तहत सकारात्मक GFP और कैसे प्रतिशत सेल उम्र के साथ बदलती हैं के प्रतिशत में रुचि रखते हैं. प्रवाह cytometry प्रत्येक अलग electroporation शर्तों के तहत अभिकर्मक परिणाम के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं. 8 यहाँ चित्रा कोशिकाओं है कि बीतने दिखाया प्रत्येक 12 electroporation शर्तों के तहत 5 कोशिकाओं में सकारात्मक GFP का प्रतिशत. अधिकतम अभिकर्मक प्रतिशत उच्चतम वोल्टेज घातीय क्षय नाड़ी, हालत 6, और मजबूत वर्ग तरंग पल्स के तहत 70% के तहत लगभग 80% का परीक्षण किया था, 12 शर्त. 9 चित्रा के साथ कोशिकाओं 9 बार electroporation से पहले पारित कर दिया, अभिकर्मक प्रतिशत की समग्र पैटर्न लगभग समान है, लेकिन अभिकर्मक प्रतिशत में एक बहुत ही मामूली कमी के साथ. 10 चित्रा यहाँ दिखाया गया है. बीतने 13 कोशिकाओं जो छोटी कोशिकाओं के सापेक्ष अभिकर्मक प्रतिशत में एक चिह्नित कमी दिखाने में GFP कोशिकाओं के प्रतिशत हैं. उच्चतम अभिकर्मक प्रतिशत लगभग आधे युवा के रूप में अलगाव के बाद जल्द ही संभव के रूप में स्वस्थ कोशिकाओं का उपयोग करने के महत्व का प्रदर्शन कोशिकाओं के साथ क्या हासिल की थी. Electroporation transfecting MEF जीन Pulser MXcell का उपयोग कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया स्थितियां हालत (06/01) घातीय क्षय दालों, 350 UF, 1000ohm के साथ सभी वोल्ट (वी) 1 200 2 250 3 300 4 326 5 350 6 376 हालत (12/07) स्क्वायर वेव दालों, 2000 UF, ओम 1000, और एक नाड़ी के साथ सभी वोल्ट (वी) पल्स अवधि (एमएस) 7 200 10 8 250 10 9 300 10 10 200 20 11 250 20 12 300 20

Discussion

यह वीडियो लेख दर्शाता है कि कैसे MXcell electroporation प्रणाली का उपयोग करने के लिए आसानी MEFs या अन्य प्राथमिक कोशिका लाइनों के लिए इष्टतम electroporation शर्तों की पहचान. थाली 96 अच्छी तरह प्रारूप की अनुमति देता है के लिए प्रयोगात्मक या अनुकूलन के लिए एक साथ प्रदर्शन किया जा स्थितियों, जो कई अलग प्रयोगों के लिए आवश्यकता को समाप्त कर सकते हैं के कई replicates. हालांकि इस प्रक्रिया को ले जाने, एक के लिए संभव के रूप में अलगाव के बाद के रूप में जल्द ही स्वस्थ कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए और electroporation की स्थिति है कि electroporation बफर करने के लिए मिलान कर रहे हैं का उपयोग याद रखना चाहिए.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Gene Pulser® Electroporation Buffer		Bio-Rad Laboratories, Inc.	165-2676
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System		Bio-Rad Laboratories, Inc.	165-2670
Gene Pulser MXcell™ ShockPod™ Cuvette Chamber		Bio-Rad Laboratories, Inc.	165-2673
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System With ShockPod™ Cuvette Chamber		Bio-Rad Laboratories, Inc.	165-2674