Mesure du taux plasmatique des protéines membranaires par endocytique Biotinylation réversible

Résumé

Endocytose régulée régit les niveaux de surface des cellules d'expression de la majorité des protéines membranaires. Ici, nous utilisons réductible, réactifs à membrane biotinylation imperméants pour mesurer le taux d'endocytose du transporteur de la dopamine (DAT), une protéine membranaire polytopique. La méthode facilite une approche simple pour mesurer le taux d'endocytose de la plupart des protéines de la membrane plasmique.

Résumé

Protéines membranaires sont d'un grand groupe diversifié de protéines composé de récepteurs, canaux ioniques, les transporteurs et les pompes. Activité de ces protéines est responsable d'une variété de clés des événements cellulaires, y compris la livraison des nutriments, l'excitabilité cellulaire, et la signalisation chimique. Beaucoup de protéines membranaires sont réglementés de façon dynamique par le trafic endocytaire, qui module la fonction des protéines en modifiant l'expression des protéines de surface. Les mécanismes qui facilitent l'endocytose des protéines sont complexes et ne sont pas pleinement compris pour des protéines membranaires nombreuses. Afin de bien comprendre les mécanismes qui contrôlent le trafic endocytaire d'une protéine donnée, il est essentiel que le taux de la protéine S endocytose être mesurés avec précision. Pour de nombreux récepteurs, des mesures directes de taux d'endocytose sont souvent obtenus en utilisant des ligands de récepteurs marqués. Cependant, pour plusieurs classes de protéines membranaires, comme les transporteurs, les pompes et les canaux ioniques, il n'ya pas de ligand pratique qui peut être utilisé pour mesurer le taux d'endocytose. Dans le présent rapport, nous décrivons une méthode biotinylation réversibles que nous utilisons pour mesurer le transporteur de la dopamine (DAT) Taux endocytose. Cette méthode offre une approche simple pour mesurer les taux d'internalisation, et peut facilement être employée pour des études de trafic plupart des protéines membranaires.

Protocole

Présentation de la procédure:

En utilisant cette approche, protéines de surface cellulaire sont marqués à la biotine de façon covalente sur les résidus lysine disponibles extracellulaire en utilisant une membrane imperméants, réactif biotinylation disulfure couplé (sulfo-NHS-SS-biotine) sous des conditions restrictives du trafic (c'est à dire à basse température) (voir Fig 1. pour l'illustration). Un ensemble de cellules est déplacé à la traite des conditions permissives (37 ° C) et des protéines biotinylées intérioriser. L'autre série de cellules sont maintenus à basse température que les contrôles pour 1) la protéine de surface totale au ....

Discussion

Les problèmes courants: Le problème le plus fréquent qui se pose dans ces expériences est l'efficacité de bande pauvres. L'efficacité de la bande est essentiel d'être capable d'interpréter les résultats. Sauf si la bande a été très efficace, il n'est pas possible de conclure que toutes les protéines biotinylées dans les ruelles internalisation ont été, en fait, intériorisé de la surface. Bandes d'efficacité ≥ 90% sont optimales, et nous jetez aucun résultat, si la bande tombe en dessous de.......