Separação de células de fluorescência Activated de Protoplastos Usina
Summary
Um método para isolar tipos específicos de células a partir de material vegetal é demonstrada. Esta técnica emprega linhas marcador transgênicos expressando proteínas fluorescentes em tipos de células particular, celular dissociação e classificação de fluorescência celular ativado. Além disso, uma instalação de crescimento é estabelecido aqui que facilita o tratamento de<em> Arabidopsis thaliana</em> Mudas antes da separação de células.
Abstract
De alta resolução, tipo celular específico de análise da expressão do gene aumenta muito a compreensão da regulação do desenvolvimento e as respostas aos estímulos do ambiente em qualquer organismo multicelular. A hibridização in situ e visualização gene repórter pode até certo ponto ser utilizados para este fim, mas em alta resolução quantitativa RT-PCR ou high-throughput análise de transcriptoma-wide o isolamento de RNA a partir de tipos de células em particular é necessária. Dissociação do tecido celular expressando um marcador da proteína fluorescente em um tipo específico de célula e separação de células subseqüentes Fluorescence Activated (FACS) faz com que seja possível recolher uma quantidade suficiente de material para extração de RNA, análise, síntese / amplificação e microarray de cDNA.
Um extenso conjunto de células de tipo específico linhas repórter fluorescente está disponível para a comunidade de pesquisa da planta. Neste caso, duas linhas marcador da raiz de Arabidopsis thaliana são usados: P SCR:: GFP (endoderme e centro quiescente) e P WOX5:: GFP (centro quiescente). Um grande número (milhares) de mudas são cultivadas em sistema hidropônico ou em placas de ágar e colhida para obter material suficiente raiz para análise posterior. Dissociação celular de material vegetal é obtido por digestão enzimática da parede celular. Este procedimento faz uso de plasmólise osmolaridade induzida por alta e celulases comercialmente disponíveis, pectinases e hemicelulases para liberar protoplastos em solução.
FACS da GFP células positivas faz uso da visualização do verde contra o espectro de emissão vermelha de protoplastos animado por um laser nm 488. GFP-positivos protoplastos podem ser distinguidos pelo seu aumento da proporção de verde para emissão vermelha. Protoplastos são normalmente classificadas diretamente em tampão de extração de RNA e armazenados para posterior processamento em um momento posterior.
Esta técnica é revelado para ser simples e viável. Além disso, é mostrado que ele pode ser usado sem dificuldades para isolar um número suficiente de células para análise de transcriptoma, mesmo para tipos de células muito escassos (por exemplo, células centro quiescente). Por último, uma instalação de crescimento para mudas de Arabidopsis é demonstrado que permite tratamento sem complicações da plantas, antes da separação de células (por exemplo, para o tipo específico de célula de análise de respostas de estresse bióticos ou abióticos). Suplementares potenciais usos para FACS de protoplastos de plantas são discutidos.
Protocol
Discussion
Protoplastos pode, em princípio, ser derivado de uma variedade de tecidos vegetais, otimizando as condições favoráveis irá aumentar RNA qualidade e quantidade. Tanto a solução protoplasting eo buffer de incubação eletiva utilizado irá influenciar nesse aspecto.
Muitos diferentes proteínas fluorescentes pode ser usada, dependendo das capacidades do FACS usado, por exemplo, GFP, RFP, YFP, PCP ou suas variantes muitos e derivados. A expressão dos marcadores pode ser c…
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (Grant no. DBI 0.519.984) e os Institutos Nacionais de Saúde (Grant no. 5R01GM078279) ..
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | ||
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | ||
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | ||
| Phytatrays | Sigma | P1552 | ||
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma | M5519 | ||
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | ||
| MES | Sigma | M2933 | ||
| KOH | Sigma | P1767 | 10 M stock | |
| Eclipse 90i microscope | Nikon | |||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| D-mannitol | Sigma | M9546 | ||
| KCl | Sigma | P8041 | 1 M stock | |
| BSA | Sigma | A3912 | ||
| β-mercaptoethanol | CALBIOCHEM | 444203 | ||
| CaCl2 | Sigma | C2536 | 1 M stock | |
| orbital shaker | LAB-LINE | |||
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | ||
| conical 15 ml tubes | BD Falcon | 352196 | ||
| table centrifuge | Sorvall | Legend RT | ||
| NaCl | Sigma | S3014 | ||
| FACSAria | BD | |||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR | 20170-38 | ||
| RNeasy micro kit | QIAGEN | 74004 | ||
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | ||
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
References
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