Aktiviteten i neuronala system kräver ofta synkrona aktionspotentialens utsläpp från nervceller inom en viss population. Till exempel pulser av gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) sannolikt kräver samordnad verksamhet mellan GnRH nervceller. Vi presenterar vår metod för att tillförlitligt få samtidiga elektrofysiologiska inspelningar från diffust fördelade GnRH nervceller.
Gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) är en liten neuropeptid som reglerar hypofysen frisättning av luteiniserande hormon (LH) och follikelstimulerande hormon (FSH). Dessa gonadotropiner är viktiga för regleringen av fortplantningsförmågan. Den GnRH-innehållande nervceller distribueras diffust över hela hypotalamus och projektet till medianvärdet eminens där de släpper GnRH från sina axon terminaler i hypophysiotropic portalen systemet (1). I portalen kapillärerna, reser GnRH till främre hypofysen för att stimulera frisättning av gonadotropiner i kretsloppet. GnRH-utgåvan är inte kontinuerlig utan sker i episodisk pulser. Det är väl etablerat att den intermittenta sätt GnRH-release är viktigt för reproduktion (2, 3).
Samordning av verksamheten i flera GnRH nervceller antagligen ligger bakom pulser GnRH. Totalt peptid innehåll i GnRH-neuron är cirka 1,0 pg / cell (4), varav 30% sannolikt består av öppningsbara poolen. Nivåer av GnRH under en puls (5, 6) föreslår flera GnRH nervceller förmodligen är involverade i neurosecretion. Likaså enhet aktivitet ur hypotalamus flera enheter inspelningar under LH släppa visar förändringar i aktiviteten av flera nervceller (7). Elektroderna med inspelade aktivitet under LH pulser är förknippade med antingen GnRH somata eller fibrer (8). Därför åtminstone en del av denna verksamhet härrör från GnRH nervceller.
De mekanismer som resulterar i synkroniserade bränning i hypothalamus GnRH nervceller är okänd. Belysa de mekanismer som samordnar eldning i GnRH nervceller är ett komplext problem. För det första GnRH nervceller är relativt få till antalet. Hos gnagare är det 800-2500 GnRH nervceller. Det är inte klart att alla GnRH nervceller är inblandade i episodisk GnRH-release. Dessutom är GnRH nervceller diffust ut (1). Detta har komplicerat vår förståelse av samordning av bränning och har gjort många tekniska metoder svårlösta. Vi har optimerat lös cell-anslutna inspelningar i nuvarande-clamp läge för direkt detektion av aktionspotentialer och utvecklat en inspelning metod som möjliggör samtidig inspelningar från par GnRH nervceller.
Aktiviteten av intresse i vissa nervceller inklusive GnRH nervceller (baserat på hormon) sker på tidsskalor timmar (5-7). Därför är hela cellen konfiguration inte det bästa valet för några experimentella mål på grund av dialys av intracellulära budbärare i hela cellen inspelningsläge. I andra hand är helcells-inspelningar i allmänhet begränsad till djur yngre än ca 120 dagars ålder. Med åldern neuronala membran tycks stelna, vilket gör hög motståndskraft tätningar svårt att uppnå. Dessutom erhåller om en hög motståndskraft sigill, spricker plåstret stör tätningen och lämnar ett hål mellan pipetten och membranet. Detta leder till en oanvändbar inspelningen och en neuron som snabbt kommer att dö på grund av joniska obalanser. Regelbunden äggstockarna cykler, och därmed en stabil verksamhet GnRH pulsgenerator inte sker förrän senare i livet (7-10 månaders ålder i C57Bl6 kvinnor, 11, 12), efter den ålder då man rimligen kan förutse att få helcells-inspelningar tillförlitligt sätt. Slutligen helcells-inspelningar förstöra den endogena förhållandet mellan interna och externa jon koncentrationer. Med hela cellen inspelningar, lika med interna koncentrationen av alla jon koncentrationen av jon i pipetten lösningen. Detta beror på att pipetten lösningen relativt stor volym snabbt når jämvikt med / ersätter den relativt lilla endogena volym cellen.
Den lösa cellen bifogade tillvägagångssätt kringgår många av de begränsningar helcells-inspelningar. Dels kan ett lågt motstånd tätning (15-30 Mohm) användas. Dessa är relativt lätt att forma även i nervceller från äldre djur. För det andra gör man inte spräcka förseglade fläck membran. Därför, lös cell bifogade inspelningar är tekniskt mycket lättare än helcells-inspelningar. Dessutom, eftersom cellmembranet är intakt, sker dialys av intracellulära komponenter inte och endogena joniska nyckeltal bevaras. Man kan inte använda den lösa cellen bifogade metod för att studera synaptisk strömmar men det är idealiskt för långa inspelningar från nervceller i en relativt icke-invasiv sätt. Cellen-anslutna inspelningar kan också utföras med hjälp av en vanlig intracellulära lösning i pipetten. Detta ger den extra fördelen av spricker membranet patchen när den långsiktiga inspelningen är klar och märkning neuron med en intracellulär markör.
Den lösa cellen bifogade tillvägagångssätt har använts i spännings-clamp inspelningsläge. Dock har spänning-klämma in i den lösa cellen bifogade konfiguration flera metodologiska problem. För det första är inspelade signalen ett indirekt mått på aktivitet. Den signal som mäts (som den så kallade åtgärder ström) är den kapacitiva ström som laddar membranet (13). Detta är en mycket viktig metodologisk fråga. Kapacitans och motstånd av en inspelning pipett kan filtrera den inspelade signalen. Det är mycket troligt att de små åtgärder strömmar försvinner i laddning av kapacitans av pipetten som, inte kan väl kompenseras med de flesta förstärkare, på grund av det höga motstånd headstage. När dessa signaler inte upptäcks, återspeglar den uppenbara bränning mönster av neuron inte den sanna bränning mönster. Likaså okompenserad pipett och motstånd tätning orsaka betydande fel i mätningar under förändringar såsom när åtgärder strömmar uttrycks (13). Vissa förstärkare ger kapacitans och motstånd "ersättning" för pipett och sigill, vilket begränsar signal förlust, men hög motståndskraft chef stadier av de flesta förstärkare hindra optimal ersättning. För det andra är en artificiell situation som ställs på cellen. I spännings-clamp läge är området runt cellmembranet höll en fast potential i dessa studier, 0 mV. Detta betyder inte att det inte finns någon ström som appliceras på cellmembranet. Signalen mäts i spänning-clamp är faktiskt hur mycket ström som appliceras på membranet för att upprätthålla den fasta potential. Därför kan detta tillämpas aktuell förändrar cellernas aktivitet.
Dubbla inspelningar i GnRH-systemet är särskilt utmanande på grund av det begränsade antalet GnRH nervceller och deras diffusa distribution. För dubbla inspelningar ska lyckas, måste roboten vara ytterst stabil. Även liten rörelse av elektroden kan orsaka pipetten för att halka av neuron och avsluta inspelningen. Dessutom kan rörelser av pipetten på cellen (t.ex. omplacering för att kompensera för rörelser) ändra bränning mönster. Vissa jonkanaler t.ex. N-typ kalciumkanaler är mekaniskt känsliga: membran sträcka orsakar återkommande aktivitet i både hel-cell och cell-anslutna inspelning konfigurationer (14). Slutligen måste Manipulator System kunna ytterst fina och mjuka rörelser. Som nämnts ovan, med dubbla inspelningar, tar en två pipetter till ytan av de två tidigare valda nervceller samtidigt och försöker att tätaen neuron. Om det lyckas, då ett försök att försegla den andra cellen. Generellt kan man inte förvänta sig att täta och har en högkvalitativ inspelning med varje försök. Detta är dock skapar ett särskilt problem med dubbla inspelningar. Om man lyckas med de första neuron men misslyckas med andra, måste man ändra pipett och prova en annan cell. Därför måste man kunna flytta både nedsänkning målet för mikroskop och pipetten till toppen av perfusion väl (för att ändra pipett) utan att störa framgångsrikt förseglade neuron.
Vår utveckling och användning av den lösa cell-ansluten tillvägagångssätt för dubbla inspelningar är ett stort tekniskt framsteg i att studera GnRH nervceller. Det är troligt att producera användbara resultat som kommer att hjälpa att flytta fältet framåt i samband med den kritiska frågan om vilka mekanismer som ligger bakom samordnad verksamhet som resulterar i pulserande hormon.
Jag är tacksam mot Ronald L. Calabrese, Dieter Jaeger (Emory University) och Ward Yuhas (Axon Instruments) för användbara tekniska diskussioner.