Este procedimiento describe un método para el aislamiento y la cultura del órgano de Corti murino con o sin el limbo espiral y las neuronas del ganglio espiral. También demostramos un método para la expresión de un gen reportero exógenos en el órgano de Corti explante de la electroporación.
En todos los mamíferos, el epitelio sensorial de la audición se encuentra a lo largo del órgano espiral de Corti que se encuentra dentro de la cóclea en forma de caracol del oído interno (fig 1). Las células pilosas en la cóclea de desarrollo, que son las células mechanosensory del sistema auditivo, se alinean en una fila de células ciliadas internas y tres (en la base y la mitad de vueltas) a cuatro (en la vuelta apical) hileras de células ciliadas externas que abarcan todo el largo del órgano de Corti. Transducción de las células ciliadas de sonido inducida por las vibraciones mecánicas de la membrana basilar en impulsos nerviosos que el cerebro puede interpretar. La mayoría de los casos de pérdida auditiva neurosensorial son causados por la muerte o la disfunción de las células pilosas cocleares.
Una herramienta cada vez más esencial en la investigación auditiva es el aislamiento y cultivo in vitro de los explantes de órganos 1,2,9. Una vez aislados, los explantes se puede utilizar de varias maneras para proporcionar información sobre normativa, anómalo, o la fisiología terapéutica. La expresión génica, la motilidad estereocilios, biología celular y molecular, así como los enfoques biológicos para la regeneración de las células ciliadas son ejemplos de aplicaciones experimentales de órgano de Corti explantes.
Este protocolo describe un método para el aislamiento y la cultura del órgano de Corti de ratones recién nacidos. El video que acompaña incluye instrucciones paso a paso para el aislamiento del hueso temporal de crías de ratón, y el posterior aislamiento de la cóclea, el ligamento espiral, y el órgano de Corti. Una vez aislado, el epitelio sensorial puede ser plateado y se cultivan in vitro en su totalidad, o como un micro-disección más aislado que carece de la espiral de limbo y de las neuronas del ganglio espiral. Usando este método, explantes primarios se puede mantener durante 7-10 días. Como ejemplo de la utilidad de este procedimiento, el órgano de Corti explantes se electroporated con un gen reportero DsRed exógenos. Este método proporciona una mejora sobre otros métodos publicados, ya que proporciona direcciones reproducible, sin ambigüedades, y paso a paso para el aislamiento, la microdisección, y la cultura principal del órgano de Corti.
Hay varios detalles que son fundamentales para el éxito de este procedimiento. Cuanto más corto sea el tiempo de aislamiento de los temporales de órgano de Corti de incubación, mayor será la posibilidad de que los órganos se conectará con el cubreobjetos y el resultado en cultivos de órganos viables. Por lo tanto, es importante limitar la cantidad de tiempo que transcurre entre la disección y la colocación de los órganos en la incubadora. La elección del antibiótico es también crucial, ya que muchos antibióticos aminoglucósidos son ototóxicos y puede provocar la muerte de las células ciliadas. A pesar de que es preferible renunciar al uso de antibióticos por completo, lo que deja abierta la posibilidad de contaminación. Por lo tanto, se sugiere el uso de 10 mg / ml ampicilina, como regla general para superar los problemas potenciales de contaminación.
El aspecto más problemático de este y otros procedimientos para el cultivo primario del órgano de Corti, es la tendencia de los órganos de flotar fuera de los platos durante la incubación. Aunque los cultivos flotantes órgano puede permanecer viable durante 5-7 días, hay inconvenientes de los órganos de cultivo flotantes. Por ejemplo, flotando cultivos de órganos a menudo veces sobre sí mismos después de 4-5 días la prestación de microscopía problemática. Posteriormente, la integridad estructural del órgano puede verse en peligro si se compara con los órganos que se han colocado a la cubreobjetos. Hemos encontrado que las siguientes técnicas ayudan a asegurar que el órgano de Corti no flota en el medio de cultivo, pero sigue siendo colocada en el cubreobjetos. En primer lugar, la capa de vidrio en el cubreobjetos 01:01 poliornitina / laminina suplementado con FBS al 20% tal como se describe. La incubación durante la noche las establecidas en el protocolo es el tiempo mínimo que la placa debe ser cubierto. En nuestro laboratorio, a menudo abrigo de todas las planchas que se necesitan para la semana y mantenerse a 4 ° C hasta el día antes de su uso cuando los movemos a la incubadora de una incubación durante la noche. En segundo lugar, después de que los órganos se transportan a la cubreobjetos recubiertos, orientar el explante de manera que los cilios de las células de pelo hacia arriba. Esta orientación facilitará la adhesión de la membrana basilar de la placa de cultivo. En tercer lugar, eliminar los medios de comunicación en el pozo para colocar el explante al plato cubierto. Esto asegurará el contacto entre la placa de cultivo y la membrana basilar y mejorar la capacidad de los explantes de adherirse al vidrio. Esto también ayudará a mantener la integridad estructural de las filas de las células ciliadas. Por último, con cuidado por goteo 2 gotas de medio de cultivo sobre la superficie del órgano de Corti con una pipeta 200 l de capacidad y poco a poco llenar el pozo por goteo y el volumen restante (de un total 130 l) en el lado del cubreobjetos. Es importante trabajar con rapidez para asegurar la fijación del órgano de Corti a la cubreobjetos recubiertos. Desde el inicio de la disección a la incubación de los explantes, por lo general toma 10 minutos para un operador de practica para completar este órgano de Corti procedimiento de aislamiento.
En este protocolo, también se presenta un método para el aislamiento de microorganismos del epitelio sensorial del limbo espiral del órgano de Corti. En este procedimiento, el limbo espiral es diseccionada en el epitelio sensorial con 28G ½ agujas de insulina como herramientas de disección. El resultado consiste en aislar los microorganismos de las filas de las células ciliadas y sus correspondientes células de apoyo (Fig. 3). El epitelio sensorial aislada se puede cultivar como se describe en este protocolo. Este procedimiento de aislamiento de micro-debe compararse con la separación enzimática de los epitelios sensoriales del tejido circundante 4. En los mamíferos, así como especies no mamíferas, tales como pollos, la digestión termolisina de que los resultados órganos vestibulares en el aislamiento de los epitelios sensoriales de las células mesenquimales sótano 4. En la rata cóclea, los resultados termolisina la digestión en la separación de la cresta superior del epitelio, menor cresta epiteliales y el epitelio sensorial que acompaña a la membrana basal 5. Sin embargo, no está claro si el epitelio sensorial coclear pueden adherirse a las placas de recubrimiento sin las células mesenquimales de acompañamiento. Mientras tanto en el micro-mecánica aislamiento método y el resultado enzimática método de digestión en la separación de los epitelios sensoriales del limbo espiral, las ventajas de la disección de micro-aislar a la digestión termolisina incluye un protocolo relativamente corto, más barato reactivos, y el estrés potencialmente menos el explante debido a los efectos de la digestión enzimática. Además, la membrana basal permanece intacta en este enfoque, que puede mejorar la conexión del epitelio sensorial de la placa de cultivo. Las desventajas de este método incluyen la necesidad de desarrollar las habilidades en la disección delicada y el daño potencial a la mecánica del epitelio sensorial como resultado de la disección micro.
Como ejemplo de la utilidad de este procedimiento, también presentamos un ejemplo de la utilización de los órganos deCorti culturas, la electroporación de genes exógenos en el explante cultura. El procedimiento de electroporación descrito anteriormente se basa en los métodos anteriores de órgano de Corti electroporación. En particular, Zheng y Gao (2000) describen la electroporación de los órganos aislados de ratas de Corti, donde los explantes se mantienen en su lugar para la electroporación por un surco trazado de agarosa y chapada en colágeno recubiertas de 8 y diapositivas Labtek en medio libre de suero 2. Una de las ventajas de su enfoque es que los órganos están orientados de manera que las superficies superiores de los explantes de la cara del cátodo, que en teoría debería resultar en una distribución uniforme de las células por electroporación en todo el explante. En nuestras manos sin embargo, el método que se describe mejor en este procedimiento debido a que el órgano de Corti quedó fijada en el cubre todo el procedimiento lo que se reduce la manipulación de los explantes después de la electroporación. Además, un porcentaje más alto de los órganos de Corti se mantuvo unido a los cubreobjetos utilizando este método que se presenta. Nuestro método se ha tomado de Jones, et al. (2006) que utiliza la adición de la Fugene 6 reactivo para aumentar la eficiencia de la expresión génica después de la electroporación. En el protocolo de Jones et al. (2006), los órganos se someten a electroporación, se incubó durante 5 minutos con 100 l de reactivo de transfección Fugene 6, y se colocaron 6. Nuestro método difiere en el uso de una proporción de 3:2 de Fugene 6 reactivo al ADN plásmido, que hemos encontrado empíricamente para proporcionar la expresión transgénica óptima con toxicidad orgánica mínima. Nosotros no usamos sin diluir Fugene 6 reactivo, que puede resultar en toxicidad a los cultivos. La configuración de los electrodos en el protocolo, así como Jones et al. (2006), los resultados en la expresión génica primaria, ya sea en la espiral de limbo o epitelio sensorial dependiendo de la posición del cátodo. Aunque hay DsRed células positivas en el lado lejano de la cultura hacia el cátodo, hay una mayor concentración de células transgénicas más cerca del cátodo. Para asegurar una completa expresión del transgén en ambos lados del órgano de Corti explante, la corriente puede ser revertida por un tren de pulsos segundo, simplemente invirtiendo los cables. Los resultados presentados en el protocolo de sólida expresión de los transgenes a través del órgano de Corti (Fig. 5).
Los autores desean agradecer a Danielle y Demêmes Cotanche Douglas y por sus esfuerzos en enseñarnos los métodos para el aislamiento del órgano de Corti. Además, nos gustaría dar las gracias a Ismael Stefanov-Wagner para la ingeniería de los electrodos electroporador; Sherry Lin por su obra que contribuyen a la animación de vídeo, y Mateo Chana, Jason Meeker, y Kendra Marshall ( www.goodfightproductions.com ) para producir el vídeo. Este trabajo fue financiado por subvenciones (R03DC010065-Parker, RO1DC007174-Edge; P30DC05209-MEEI apoyo básico para la Investigación de la Audición) de la NIDCD.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Glass microscope coverslips | DYNALAB Corporation (Rochester, NY) | 2010 | 10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce | |
4 ringed cell culture dish | Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 627170 | Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO) | P4957 | 0.01% Solution | |
Laminin | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) | 354232 | made in mouse | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 26140-095 | Qualified | |
Operating scissors | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | RS-6806 | Straight, sharp-blunt length 5″ | |
#11 Scalpel Blade | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 372611 | ||
#4 Dumoxel forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11241-30 | ||
#55 Dumostar fine forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11295-51 | ||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 10564-011 | High Glucose | |
Horse Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 2605088 | Heat Inactivated | |
Ampicillin Sodium Salt | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11593-027 | Irradiated | |
½ cc Lo-Dose Insulin Syringe | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 329465 | U-100 28G½ | |
Fugene 6 Transfection Reagent | Roche (Mannheim, Germany) | 11-815-091-001 | ||
Polystyrene test tube | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 14-956-5A | ||
Laminar flow hood | The Baker Company (Stanford, ME) | Model SG603a | SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet |
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Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985 | ||
Reporter plasmid | Clontech (Mountain View, CA) | 632539 | pCMV DsRed-Express 2 | |
Electroporator | BioRad (Hercules, CA) | 165–2662 | BioRad Gene Pulser Xcell |