डीएनए नकल एंजाइमों का प्रत्यक्ष प्रेक्षण एक एकल अणु डीएनए परख टूटती का उपयोग
Summary
हम व्यक्तिगत डीएनए जीवाणुभोजी प्रतिकृति प्रणाली के प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता अणुओं की वास्तविक समय प्रतिकृति के अवलोकन के लिए एक विधि का वर्णन.
Abstract
हम व्यक्तिगत डीएनए जीवाणुभोजी प्रतिकृति प्रणाली के प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता अणुओं की वास्तविक समय प्रतिकृति के अवलोकन के लिए एक विधि का वर्णन. Linearized λ डीएनए के एक भूग्रस्त के अंत पर एक बायोटिन, और ही भूग्रस्त के दूसरे छोर पर एक digoxigenin आधा भाग है संशोधित किया गया है. biotinylated अंत functionalized कांच coverslip और एक छोटे से मनका के digoxigeninated अंत से जुड़ी है. एक प्रवाह सेल की सतह पर इन डीएनए मनका tethers के विधानसभा लामिना का प्रवाह के लिए मनका पर एक खींचें बल लागू लागू किया जा करने के लिए अनुमति देता है. एक परिणाम के रूप में, डीएनए करीब करने के लिए और एक शक्ति है कि प्रवाह की दर (चित्रा 1) द्वारा निर्धारित किया जाता है पर coverslip की सतह के समानांतर फैला है. डीएनए की लंबाई मनका की स्थिति की निगरानी के द्वारा मापा जाता है. एकल और डबल असहाय डीएनए के बीच अंतर करने के लिए लंबाई दोराहे पर प्रतिकृति प्रोटीन की गतिविधि पर वास्तविक समय जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयोग कर रहे हैं. मनका की स्थिति को मापने और unwinding के डीएनए और polymerization (चित्रा 2) के दरों processivities के सटीक निर्धारण की अनुमति देता है.
Protocol
Discussion
यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि खींचें लामिना का प्रवाह द्वारा मनकों पर exerted बल प्रतिकृति प्रोटीन के enzymatic गतिविधियों को प्रभावित नहीं करता है है. उदाहरण के लिए, एक 3 PN शक्ति है कि 0.012 मिलीग्राम / मिनट की ए?…
Acknowledgements
परख खींच डीएनए के विकास पॉल Blainey, जोंग – बोंग ली, और समीर हमदान द्वारा सहायता प्राप्त किया गया था. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान के चार्ल्स (GM54397) रिचर्डसन, और एंटोनी वैन Oijen (GM077248) संस्थान के द्वारा समर्थित है.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bacteriophage λ DNA | New England Biolabs | N3011L | ||
| DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | ||
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | ||
| α-digoxigenin Fab | Roche | 11214667001 | ||
| Tosyl Activated Beads | Dynal/Invitrogen | 142-03 | ||
| Magnetic Separator | Invitrogen | Dynal MPC | ||
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma | A3648 | Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces | |
| Succinimidyl propionate PEG | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
| Biotin-PEG-NHS | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
| Double-sided tape | Grace BioLabs | SA-S-1L | 100 μm thickness | |
| Quartz slide | Technical Glass | 20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H) | Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net) | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson | 427416 | 0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted. |
|
| Streptavidin | Sigma | S4762 | Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3 | |
| Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix | New England Biolabs | N0447 | ||
| Inverted Optical Microscope with 10X Objective | Olympus | Olympus IX-51 | ||
| Permament rare-earth magnet | National Imports | www.rare-earth-magnets.com | ||
| CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Fast 139 | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 11 Plus | Operate in refill mode to facilitate solution changes | |
| Fiber Illuminator | Thorlabs Inc. | OSL1 |
References
- Lee, J. B. DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication. Nature. 439, 621-624 (2006).
- Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. J Vis Exp. , (2009).
- Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457, 336-339 (2009).
- van Oijen, A. M. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
