A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

Summary

Nós descrevemos um método para observar a replicação em tempo real de moléculas de DNA individual mediada por proteínas do sistema de replicação bacteriófago.

Abstract

Nós descrevemos um método para observar a replicação em tempo real de moléculas de DNA individual mediada por proteínas do sistema de replicação bacteriófago. Linearizada λ DNA é modificada para ter um biotina na extremidade de um fio, e uma porção digoxigenina na outra extremidade do fio mesmo. O fim biotinilado é anexado a uma lamela de vidro funcionalizadas eo fim digoxigeninated para uma pequena pérola. A montagem destas amarras DNA-pérola sobre a superfície de uma célula de fluxo permite um fluxo laminar para ser aplicado a exercer uma força de arrasto na esfera. Como resultado, o DNA é esticada próximo e paralelo à superfície da lamínula, a uma força que é determinado pela taxa de fluxo (Figura 1). O comprimento do DNA é medida através do monitoramento da posição do talão. Diferenças de comprimento entre o DNA de um único e double-stranded são utilizados para obter informações em tempo real sobre a atividade das proteínas de replicação na bifurcação. Medir a posição do talão permite a determinação precisa das taxas e processivities de DNA descontrair e polimerização (Figura 2).

Protocol

1. Modelo de replicação do DNA DNA para a reação é um DNA λ linearizada modificado por anelamento de oligonucleotídeos para formar uma forquilha de replicação. Além disso, biotina é anexado ao final de uma vertente do DNA λ, e uma porção digoxigenina está ligado à outra extremidade do fio mesmo 1. Materiais: Bacteriófago λ DNA, Oligonucleotídeos: braço garfo biotinilado (A: 5'-biotina-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGA…

Discussion

É importante assegurar que a força de arrasto exercida sobre contas pelo fluxo laminar não influencia atividades enzimáticas das proteínas de replicação. Por exemplo, uma força de 3 pN que corresponde a uma vazão de 0,012 ml / min não afetam a replicação do filamento de DNA de liderança. Isto, contudo, afetar as atividades enzimáticas que ocorrem durante a síntese de DNA coordenada, e, portanto, tem que ser reduzida para 1,5 pN. A força de arrasto pode ser facilmente controlado, alterando a taxa de fluxo…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Bacteriophage λ DNA		New England Biolabs	N3011L
DNA Oligonucleotides		Integrated DNA Technologies
T4 DNA Ligase		New England Biolabs	M0202L
T4 Polynucleotide Kinase		New England Biolabs	M0201L
α-digoxigenin Fab		Roche	11214667001
Tosyl Activated Beads		Dynal/Invitrogen	142-03
Magnetic Separator		Invitrogen	Dynal MPC
3-aminopropyl-triethoxysilane		Sigma	A3648	Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG		Nektar		Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS		Nektar		Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Double-sided tape		Grace BioLabs	SA-S-1L	100 μm thickness
Quartz slide		Technical Glass	20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)	Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing		Becton Dickinson	427416	0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted.
Streptavidin		Sigma	S4762	Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix		New England Biolabs	N0447
Inverted Optical Microscope with 10X Objective		Olympus	Olympus IX-51
Permament rare-earth magnet		National Imports	www.rare-earth-magnets.com
CCD Camera		QImaging	Rolera-XR Fast 139
Syringe Pump		Harvard Apparatus	11 Plus	Operate in refill mode to facilitate solution changes
Fiber Illuminator		Thorlabs Inc.	OSL1