ייצור והפעלת הוספת חמצן עבור תרבויות נייד חסיד

Summary

ייצור ואימות של פלטפורמת התוספת על המציע שליטה משופרת על חמצון במרחב ובזמן בצלחת 6 באר. המכשיר להתאמה מספר מערכות התרבות יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של חמצן על ריפוי הפצע.

Abstract

החמצן הוא אפנן המפתח של מסלולים סלולריים רבים, אך המכשירים הנוכחי המתיר<em> במבחנה</em> אפנון חמצן מצליחים לענות על הצרכים של מחקר ביו. חדר היפוקסי מציע מערכת פשוטה לשליטה חמצון בכלי תרבות רגילה, אך חסר שליטה של ​​זמן ומרחב מדויק על ריכוז החמצן על פני השטח של התא, דבר המונע יישומה בלימוד מגוון רחב של תופעות פיזיולוגיות. מערכות אחרות השתפרו על חדר היפוקסי, אך דורשים ידע ציוד מיוחד עבור המבצע שלהם, מה שהופך אותם מאיימת לחוקר הממוצע. הכנס microfabricated עבור צלחות multiwell פותחה כדי לשלוט באופן יעיל יותר את ריכוז החמצן ומרחב לתופעות פיזיולוגיות מצאו מודל טוב יותר<em> In vivo</em>. הפלטפורמה כוללת להוסיף polydimethylsiloxane כי קינים לתוך צלחת multiwell רגיל ומשמש רשת הגז פסיבי microfluidic עם קרום חדיר גז שנועד לווסת את אספקת החמצן לתאים חסיד. המכשיר פשוט לשימוש מחובר מיכלי גז המספקים את הלחץ כדי להציג את ריכוז החמצן הרצויה לתוך הרציף. ייצור כולל שילוב של photolithography SU-8 סטנדרטי, דפוס העתק, ו PDMS מוגדר ספינינג על פרוסות סיליקון. הרכיבים של המכשיר מודבקים לאחר טיפול פני השטח באמצעות מערכת המוחזק ביד פלזמה. אימות מושגת באמצעות חיישן חמצן מישוריים ניאון. זמן איזון הוא בסדר גודל של דקות, מגוון רחב של פרופילים החמצן ניתן להשיג מבוסס על עיצוב המכשיר, כגון פרופיל מחזורית שהושג במחקר זה, ואפילו הדרגתיים חמצן לחקות את אלה שנמצאו<em> In vivo</em>. המכשיר יכול לעקר עבור תרבית תאים באמצעות השיטות הנפוצות ללא אובדן תפקוד. של התקן הישימות ללימוד<em> במבחנה</em> ריפוי הפצע התגובה יהיה הפגינו.

Protocol

1. התקן פונקציה המכשיר להכניס hypoxic מכיל 6 עמודים כי קן לתוך צלחת 6-היטב סטנדרטי. הגז זורם לתוך העמוד, ברשת microfluidic בבסיס העמוד, זורם בחזרה מתוך המכשיר. בבסיס העמוד להרכיב את הקיר התחתון של microchannel הוא קרום עבה 100 מיקרומטר גז חדיר PDMS המאפשר דיפוזיה חמצן בין הגז microchannel והתקשורת והתרבות. לכן, המכשיר פועל על ידי יצירת שיפוע הריכוז שמניע את ריכוז החמצן התקשורת לקראת הערך הרצוי. המכשיר מציע מספר יתרונות על פני החדר hypoxic אחרים חמצון מערכות תאים: 1) ממזער את דיפוזיה חמצן נתיב המאפשר שליטה הזמני מהר יותר, 2) משפר את השליטה במרחב מעל חמצון, כמו תלויים על עיצוב עמוד microchannel, 3) הוא בעל טביעת מעבדה קטנות תפוקה גבוהה יותר כדי להגביר את יעילות הניסוי, ו 4) מסתגל נפוץ בתרבות כלים התא (לדוגמא צלחת multiwell) ללא צורך בידע ציוד מיוחדים. 2. התקן ייצור ראשית מערך האומנה היא העתק יצוק עם PDMS בדפוס Delran במכונה בעבר. הבא הגז microchannel בתחתית כל עמוד הוא מפוברק באמצעות תקן SU-8 photolithography דפוס PDMS העתק. גז קרום חדיר הוא מפוברק על ידי ספינינג מוגדרת של PDMS על פרוסות סיליקון כדי להגיע לעובי הרצוי. בדוגמה זו אנו משתמשים קרום 100 מיקרומטר עבה אשר היה מפוברק ספינינג 500 סל"ד למשך 10 שניות ולאחר מכן 900 סל"ד למשך 30 שניות. כל הרכיבים מחוברים יחד לאחר טיפול חמצן פלזמה עם מכשיר פלזמה כף יד (דגם BD-20, אלקטרו טכני מוצרים). 3. התקן ההתקנה הכנס בעדינות לתוך הצלחת המכשיר, ולוודא כדי למנוע בועות. Angling את המכשיר במהלך הכניסה עוזר לגרש את בועות צד אחד. עבור מבוססי תאים ניסויים בפועל, צעד זה חייב להיעשות בתוך ברדס זרימה למינרית סטרילי. הסיכויים הם זיהום מופחת במידה ניכרת פעם את המכשיר מוכנס, כך ההרכבה יכולה להתבצע מעל החממה בסביבה לא סטרילית. חיבור צינור הגז מטנק מקור ליציאות מפרצון ו לשקע של המכשיר. עבור מבוססי תאים ניסויים, בחממה תרבות צריכה חור כדי לאפשר כניסה צינורות, צינורות צריך להיות מחובר לאחר שנשא את המכשיר ומעמידים אותו לתוך החממה. היזהר, כדי למנוע הפעלת לחץ עודף על המכשיר, אשר יכול לעוות PDMS מספיק כדי למחוץ את התאים הבסיסית. ודא וסת זרימה דיוק סגור לפני פתיחת הרגולטור גופייה להימנע גדותיו את המכשיר. הפעל את זרימת הגז. בעדינות דיוק לפתוח זרימת הרגולטור על קצב הזרימה הרצוי (5-10 mL / min). צפה ערך מקרוב בשעה הקרובה ולבצע התאמות כנדרש, שכן ירידה בלחץ ישתנה בזמן שהמערכת המאזן, לשנות את קצב הזרימה. כדי למנוע היווצרות של בועות בתקשורת, להקטין את קצב זרימת דקות בין 10-20 מ"ל / אחרי משך 15 דקות הראשונית איזון עם קצב זרימה גבוה יותר. לאחר תקופת הניסוי הרצוי, לעצור זרימת הגז, להסיר את צלחת, ותאי תהליך בהתאם (למשל lyse, כתם, לספור וכו '). 4. התקן אימות כיול בחר את מספר ומיקום עמדות על החמצן פלורסנט (שועלי) להחליק חיישן (בהתאם לדרישות אימות) אשר ישמשו למדידת חמצן. שקופית מכיל רותניום פלורסנט צבע ציפוי כי הוא הרווה על ידי חמצן. לחשוף שקופית ישירות 0, 10, חמצן 21% מטנק גז לצלם תמונות אחרי 5 דקות של איזון נאות. ייצוא עוצמת התמונה מתכוון לכל תפקיד ואת חמצון ריכוז העלילה כמו תלויה בעוצמת ניאון. יצירת עקומת כיול על ידי עקומות ליניארי מתאים לקו 0-10% ו קו 10-21%. הטרוגניות הקמת מספר רב של נקודות פורש את רוחב הערוץ במרווח מוגדר (למשל, כל 1 מ"מ). שים לב כי ייתכן שיש חפיפה של תמונות בהתאם המרווח. מדוד את ריכוז החמצן על פני השטח גם דרך המכשיר אזון בחר שלוש נקודות בשקופית שועלי בו כדי למדוד את ריכוז החמצן. מיד לאחר לכידת התמונה הראשונה ברמות החמצן הסביבה, לפתוח את זרימת דיוק הרגולטור כדי להתחיל לזרום גז לתוך המכשיר. צלמו תמונות בהפרש המתאים כדי להעריך את משך הזמן והיקף concentr חמצןאיזון ation (למשל כל 10 שניות למשך 30 דקות). 5. יישומים ריפוי פצעים יום לפני הניסוי, להשרות את הכנס מעוקרים PDMS במדיום סרום ללא לצמצם את לדכא היווצרות בועות הגז בבאר. התרבות התאים 100% confluency בצלחת 6 באר. צור שריטות ישר monolayers עם טיפ פיפטה p200 לדמות פצעים. לשאוב התקשורת הסלולרי, לשטוף עם 5 מ"ל התקשורת, ואת לשאוב שוב. חשוב לא להפריע monolayer של תאים. מילוי בארות בינוני עם 4 בסרום ללא מ"ל כדי להפחית שגשוג תאים. מקום להכניס לתוך בארות ולהתחבר כל טוב ריכוז החמצן המתאים. מקום 6 גם להוסיף צלחת עם על הבמה מחומם על 37 ° C. לכידת זמן לשגות תמונות של התאים במרווח הרצוי משך מוחלט. T_Scratch של MATLAB, אלגוריתם למדידת הפצע, ניתן להשתמש בהם כדי לנתח את פני השטח נרפאו. 6. נציג תוצאות התקן אימות המכשיר להכניס hypoxic תערוכות שיפורים גדולים מעל תא hypoxic במונחים של זמן חמצן איזון וההיקף, הדורשים פחות מ 2 דקות כדי לייצב לחמצן 0.5%. קרום גם מכשיר בגודל הפער בתחתית היה גורם מכריע בקביעת יעילות איזון, עם פער גדול בגדלים הדורשים יותר זמן כדי להגיע היציב ריכוז חמצן ערכים. המכשיר גם מאפשר מידה רבה של שליטה על חמצון המרחבי היטב יחיד, ומאפשר היווצרות של מספר תנאים, ואף יצירת פרופיל חמצן מחזורית פני הבאר. ריפוי פצע Monolayers Cell נחשפו חמצן 10% או 21% ואת שטח הפנים של הפצע נותח במשך הזמן. שריטות נחשף לחמצן 21% סגר את האיטי ביותר ו -10% בקצב המהיר ביותר. איור 1 מציג תמונות של שריטה במשך 17 שעות. הגרפים באיור 5 מראים את אחוז השטח פצע פתוח לשני ריכוזי חמצן למשך הניסוי. באיור 1. סכמטי ודיאגרמות הממחישות תכונות המכשיר. המכשיר להכניס חמצן הוא מפוברק על ידי photolithography קונבנציונאלי (רשת microfluidic) דפוס העתק (רשת microfluidic והכנס הפיגום), ומוגדר ספינינג של PDMS (גז קרום חדיר). א) מכשיר חמצן מקוננות לתוך צלחת 6 באר. ב) דוגמאות של 24 ו 96, גם מערכים העמוד. ג) סכמטית חתך של עמוד. חמצן זורם לתוך המכשיר דרך כניסת ונוסע ברשת microfluidic בתחתית העמוד. חמצן יכול באופן חופשי מפוזר על פני קרום חדיר PDMS גז בתחתית העמוד ולפרוץ התקשורת והתרבות. ד) תמונת מיקרוסקופ מראה את התכונות השונות של עמוד ערוץ אחד מלמעלה, עם הודעות זכוכית מלוכדות עבור מחקרים איזון. איור 2. אימות של המכשיר עם חיישני חמצן. מתח חמצן היטב בתוך כל התאפיינה באמצעות חיישן חמצן מישוריים רותניום. כל התערובות הכילו חמצן וחנקן מאוזנת 5% CO 2 עבור חציצה התקשורת. א) מגרש הממחישות את ההשפעה של גובה לפרסם, מרחק דיפוזיה חמצן וכך בין קרום ותאים, על הזמן איזון ויעילות. הייטס הוקמו על ידי בדולח ההודעות כבול אל החלק התחתון של המכשיר. כל שלושת הגדלים לפרסם תשואה פעמים איזון משופר הרבה מעל חדר היפוקסי. שים לב כי הזמן הוא בקנה מידה יומן. ב) עלילה המתארת ​​את החמצן מהיר איזון זמן תגובה של המכשיר 0.2 מ"מ הפער. ג) Multi-עמדת linescans נלקחו גם תחת microchannel ברחבי היטב כדי להבטיח הומוגניות של ריכוז החמצן הוצג על ידי המכשיר. גרף המתאר את ריכוז החמצן שנמדד לאחר יציקת 0%, 10%, חמצן 21% עבור 10 דקות. ד) התקן ביעילות שומרת חמצן 10% על פני 5 ימים. איור 3. ניסויים עם עיצובים מורכבים יותר חמצן microchannel. א) הגדרת מצב Dual-microchannel מניב יציב 0% ופרופיל חמצן 21% לעומת 14 ימים. ב) דפוס interdigitated ומפותלת של 500 מיקרומטר רוחב microchannels הארכת ברחבי הדואר תוצאות עמוד הפרופיל חמצן מחזורית. שים לב כי הנתונים רק משפט אחד מתאר נציג כמו יישור microchannel היה קשה. איור 4. תמונות Timelapse סגירת הפצע 0, 7, ו – 17 שעות לאחר שריטה הראשונית. תאים נמסרו חמצן 21% לאורך משך הניסוי. איור 5. השפעת ריכוז החמצן על קצב ריפוי הפצע assay שריטה.

Discussion

המכשיר הוא מפוברק על ידי photolithography SU-8 סטנדרטי, דפוס העתק, ומוגדר ספינינג עשוי כולו polydimethylsiloxane. הגז מוחדר מכשיר להקים שיפוע הריכוז בין העמוד microchannel והתקשורת תרבות, הנהיגה את המערכת לכיוון ריכוז החמצן הרצויה שיווי משקל. המכשיר הוכח ביעילות לווסת את החמצון של זמן ומרחב בתוך היטב, וכן לווסת התנהגות הסלולר בהתאם. דפוסים מרחביים של חמצון מוגדר על ידי microchannel בבסיס העמוד, כך מגוון רחב של עיצובים יכול להיות מיושם ב crafting photomask. בנוסף, עירוי של גז הרצוי לשלב גז הבאר צפוי לשפר את זמן איזון וההיקף של היפוקסיה. רשת ערבוב microfluidic יכול להיות מותאם המכשיר כדי לספק אמצעי כדי לייצר תערובות גז הרומן של רק כמה מיכלי גז המניות. לבסוף, מנגנון התקשורת החליפין היה מבטל את הצורך להסיר את המכשיר מהצלחת multiwell, אשר התאים עשויים להגיב.

המכשיר כולל יישומים בכל במבחנה או ניסוי לשעבר vivo הדורשים שליטה על ריכוז החמצן. כמו חמצן הוא משתנה פיזיולוגי חשוב המשפיע על רוב רובם של מסלולי איתות, תחומי המחקר שתועיל מוגבל על ידי יצירה של החוקר. כמה שדות ירוויחו השליטה הזמני משופרת של ריכוז החמצן כוללים גרורות סרטן, דום נשימה בשינה, פגיעה לבבית reperfusion איסכמיה, בקרב רבים אחרים. לדוגמה, היפוקסיה לסירוגין כבר בקורלציה עם סרטן פולשני יותר, upregulating מספר metastastis הקשורים גנים ביחס היפוקסיה normoxia רציפה. השליטה במרחב חשוב גם, כפי הדרגתיים חמצן הם קריטיים בהתפתחות, zonation כבד, רעילות התרופה, ואת הנישה בתאי גזע. המכשיר שהוצג במאמר זה ייהנו מספר תחומים של מחקר על ידי מתן מערכת עם טביעת רגל קטנה מעבדה, דרישות מבצעיות פשוטות יחסית, וכן שליטה רבה יותר על חשיפה חמצן לתאים.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PDMS-Sylgard 184		Dow Corning
Planar FOXY sensor		Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Coated microscope slide
Gas regulator		Omega	FL-1472-G
Gas		Airgas	Custom mixes	All have 5% CO2
SU-8 2150		Microchem
MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine		SAFC Biosciences	M3803
Fetal Bovine Serum		ATCC	30-2020
Trypsin-EDTA		Sigma	T4049
L-Glutamine solution		Sigma	G7513