Изготовление и эксплуатация Кислород Вставка для Приверженец клеточных культур

Summary

Изготовление и проверка дополнения платформы, которая предлагает улучшенный контроль над пространственным и временным оксигенации в 6-луночный планшет. Устройство может адаптироваться к числу культуры системами и может быть использован для изучения влияния кислорода на процесс заживления ран.

Abstract

Кислород является ключевым модулятором многих клеточных путей, однако в настоящее время приспособлениями, облегчающими<em> В пробирке</em> Кислорода модуляции не в состоянии удовлетворить потребности биомедицинских исследований. Гипоксических камеры предлагает простую систему контроля кислорода в стандартных судов культуры, но не хватает точной временной и пространственный контроль за концентрацией кислорода на поверхности клетки, препятствуя ее применение в изучении различных физиологических явлений. Другие системы улучшились после гипоксической камере, но требуют специальных знаний и оборудования для их эксплуатации, что делает их запугивание для среднего исследователя. Microfabricated вставки для пластин многоямного был разработан, чтобы более эффективно управлять временными и пространственными концентрации кислорода на лучшую модель физиологических явлений найдены<em> В естественных условиях</em>. Платформа состоит из вставки полидиметилсилоксан, что гнездятся в стандартной пластине многоямного и выступает в качестве пассивного микрожидкостных газовой сети с газовой мембраны направленных модулировать доставки кислорода к прилипшие клетки. Прибор прост в использовании и связан с газовыми баллонами, которые обеспечивают давление ввести желаемую концентрацию кислорода в платформу. Производство включает в себя комбинацию стандартной SU-8 фотолитографии, реплики литье, и определены PDMS вращение на кремниевой пластине. Компоненты устройства крепятся после обработки поверхности использованием ручной плазменной системы. Проверка выполняется с помощью плоских флуоресцентных кислородного датчика. Уравновешивание время порядка минуты и широкий спектр профилей кислорода может быть достигнуто на основе конструкции прибора, такие как циклический профиль, достигнутые в этом исследовании, и даже кислородный градиент, чтобы имитировать те, что<em> В естественных условиях</em>. Устройство можно стерилизовать для клеточных культур с использованием общих методов без потери функции. Устройства применимости к изучению<em> В пробирке</em> Заживления ран ответ будет продемонстрировано.

Protocol

1. Функция прибора Гипоксических устройство вставки содержит 6-столбы, которые гнездятся в стандартной 6-луночный планшет. Газ поступает в столб, через микрожидкостных сети на базе столб, и течет обратно из устройства. У основания столба формирования нижней стенке микроканальных является толщиной 100 мкм газопроницаемых PDMS мембрана, которая позволяет диффузии кислорода между газом микроканальных и питательных сред. Таким образом, устройство работает путем создания градиента концентрации, что диски концентрации средств массовой информации по отношению к кислороду нужное значение. Устройство обладает рядом преимуществ по сравнению с гипоксически камеры и других систем оксигенации ячейки: 1) сводит к минимуму пути диффузии кислорода позволяет быстрее временной контроль, 2) улучшает пространственную контроль над оксигенации, так как зависит от столба микроканальных дизайн, 3) обладает меньшую площадь лаборатории и более высокую пропускную способность увеличить эффективность экспериментальных и 4) адаптируется к общей культуре клеток инструментов (например многоямного пластины) без требования специальных знаний и оборудования. 2. Устройство изготовления Первый столп массив реплики формованные с PDMS в ранее обрабатываемых плесень Delran. Следующая газа микроканальных в нижней части каждого столба изготовлен с использованием стандартных SU-8 фотолитографии и PDMS реплики формования. Газа мембрана изготавливается по заданному прядение PDMS на кремниевой пластине для достижения требуемой толщины. В этом примере мы используем толщиной 100 мкм мембрану, которая была изготовлена ​​на спиннинг 500 оборотов в минуту в течение 10 секунд, а затем 900 оборотов в минуту в течение 30 секунд. Все компоненты соединены вместе после кислорода плазменной обработки с портативного устройства плазмы (модель BD-20, Electro-Technic продукты). 3. Устройство установки Аккуратно вставьте устройство в пластину, удостоверяясь, чтобы избежать пузырей. Рыбалка устройство во время вставки помогает изгнать из пузырьков с одной стороны. Для реальных клеточных экспериментов, этот шаг необходимо сделать внутри стерильного ламинарном боксе. Шансы на загрязнение значительно снижаются раз устройство вставляется, так что собрание может быть перенесено на инкубатора в нестерильных окружающей среды. Подключите трубку от бензобака источника входного и выходного портов устройства. Для клеточных экспериментов, культуры инкубатора должны иметь отверстия для разрешения трубы входа и трубки должны быть подключены после проведения устройства и поместив его в инкубатор. Будьте осторожны, чтобы не ставить избыточное давление на устройство, которое может привести к деформации PDMS достаточно, чтобы подавить основные клетки. Убедитесь, что регулятор точности поток закрывается до открытия регулятора майку, чтобы избежать переполнения устройства. Начать поток газа. Аккуратно откройте регулятор потока точности требуемый расход (50-100 мл / мин). Часы значение тесно в течение следующего часа и вносить коррективы по мере необходимости, так как падение давления будет меняться, пока система уравновешивает, изменение скорости потока. Чтобы избежать образования пузырьков в средствах массовой информации, снизить расход до 10-20 мл / мин после начальной длительностью 15 минут уравновешивания с выше скорости потока. После желаемого экспериментальных продолжительность остановки потока газа, удалить пластину, и процесс клетки соответствующим образом (например лизировать, пятна, граф, и т.д.). 4. Устройство проверки Калибровка Выберите количество и расположение позиций на флуоресцентные кислорода (FOXY) датчик слайдов (в зависимости от проверки требования), которые будут использоваться для измерения кислорода. Слайд содержит флуоресцентный краситель покрытие рутений, что тушится кислородом. Expose слайд прямо на 0, 10, и 21% кислорода из топливного бака и захвата изображений через 5 минут для правильного равновесия. Экспорт средняя интенсивность изображения для каждой позиции и концентрации участок оксигенации зависит от флуоресцентной интенсивности. Создание калибровочной кривой путем установки линейных кривых на 0-10% линии и 10-21% линии. Гетерогенность Создание нескольких точек охватывающих ширину канала на определенный интервал (например, раз в 1 мм). Обратите внимание, что там может быть перекрытие изображений в зависимости от расстояния. Мера концентрации кислорода на поверхности и с помощью устройства Уравновешивание Выберите три точки на FOXY слайд, в котором для измерения концентрации кислорода. Сразу же после захвата первого изображения при комнатной уровень кислорода, откройте регулятор потока точность для начала газового потока в устройстве. Захват изображений на соответствующий промежуток времени для оценки продолжительности и степени кислородного concentrЭйшен равновесия (например, каждые 10 секунд в течение 30 мин). 5. Применения Лечение ран За день до эксперимента, смочите стерилизовать PDMS вставки в бессывороточной среде снизить ингибируют образование пузырьков газа в скважине. Культура клетки до 100% слияния в 6-луночный планшет. Создать прямо царапины монослоев с P200 пипетки для имитации ран. Аспирируйте ячейки СМИ, промыть 5 мл СМИ и аспирации снова. Важно, чтобы не беспокоить монослоя клеток. Refill скважин с 4 мл бессывороточной среде уменьшить пролиферацию клеток. Место вставки в скважинах и подключить каждую лунку на соответствующую концентрацию кислорода. Место 6-луночный планшет с вкладышами на подогреваемых стадии при температуре 37 ° C. Захват промежуток времени изображения клеток в нужный интервал и общую продолжительность. T_Scratch MATLAB, в алгоритме раны измерения, могут быть использованы для анализа незаживающие площадь поверхности. 6. Представитель Результаты Устройство проверки Гипоксических устройство вставки экспонатов большое улучшений по сравнению с гипоксической камере по кислороду время уравновешивания и масштабы, требующие менее 2 минут для стабилизации до 0,5% кислорода. Устройство мембранного также размер разрыва дно было решающим фактором в определении равновесия эффективности, с большими размерами разрыва требуется больше времени для достижения стационарного значения концентрации кислорода. Устройство также позволяет большой контроль над пространственным оксигенации в одной скважины, что позволяет образованию нескольких условий, и даже генерации циклических профиля кислорода по поверхности хорошо. Заживление ран Сотовые монослоев подвергались 10% и 21% кислорода и площадь поверхности раны была проанализирована с течением времени. Царапины воздействию 21% кислорода закрыта медленный и на 10% быстрее. На рисунке 1 показано изображение царапины в течение 17 часов. Графики на рисунке 5, показывают, процент открытой площадке рану как для концентрации кислорода на протяжении всего эксперимента. Рисунок 1. Схема и диаграммы, иллюстрирующие функциям устройства. Устройство кислорода вставки изготовлен обычной фотолитографии (микрожидкостных сети), реплики литья (микрожидкостных сети и вставить леса), и определяется вращение PDMS (газ-мембрана). А) кислород устройство вложенные в 6-луночный планшет. Б) Примеры 24 и 96-луночного массивах столба. С) поперечного сечения Схема столба. Кислород поступает в устройство через вход и путешествует по микрожидкостных сети в нижней части колонны. Кислород может свободно проникают через газ мембрану PDMS в нижней части колонны и раствориться в культуре средств массовой информации. D) микроскопе изображение, показывающее различные особенности одноканальный столб сверху, с связаны стекла сообщений для уравновешивания исследований. Рисунок 2. Проверка устройства с датчиками кислорода. Напряжение кислорода в каждую лунку характеризовался использованием плоских кислорода рутений датчика. Все кислородных смесей, содержащейся сбалансированной азота и 5% CO 2 для буферизации информации. ) Земельный иллюстрирующие влияние сообщению высоте, и, таким образом диффузии кислорода расстояние между мембраной и клеток, на время равновесие и эффективность. Высоты были установлены граненые сообщения связаны с нижней части устройства. Все три раза после выхода размеры равновесия намного улучшилась за гипоксической камере. Обратите внимание, что время работает на логарифмической шкале. B) земельный изображающих быстрое кислорода уравновешивания время отклика 0,2 Устройство разрыва мм. С) многопозиционная linescans также были приняты во полным микроканальных для обеспечения однородности концентрации кислорода введен устройства. График изображает концентрации кислорода измеряли после вливания 0%, 10% и 21% кислорода в течение 10 мин. D) Устройство эффективно поддерживает 10% кислорода в течение 5 дней. Рисунок 3. Эксперименты с более сложными кислорода микроканальных конструкций. ) Dual условием микроканальных установки дает стабильный 0% и 21% кислорода профиля более 14 дней. Б) штыревой и извилистые структуры 500 мкм, шириной микроканалов расширения через йэлектронной столб приводит к циклической профиля кислорода. Обратите внимание, что данные только изображает одного представителя суда, как микроканальных выравнивание было трудно. Рисунок 4. Timelapse образы закрытия раны 0, 7 и 17 часов после начального нуля. Клетки были доставлены 21% кислорода по всему продолжительность эксперимента. Рисунок 5. Влияние концентрации кислорода на скорость заживления ран в царапинам анализа.

Discussion

Устройство изготавливается по стандартной SU-8 фотолитографии, реплики литье, и определены прядения и сделан полностью из полидиметилсилоксана. Газ вводится в устройство, чтобы установить градиент концентрации между столб микроканальных и питательных сред, вождение системы к желаемой концентрации кислорода равновесия. Устройство было показано, что эффективно модулировать временных и пространственных оксигенации внутри колодца, а также модулирует клеточный поведение соответствующим образом. Пространственное структурирование оксигенации определяется микроканальных у основания столба, так что разнообразие конструкций могут быть реализованы в разработке фотошаблонов. Кроме того, настой желаемого газа в газовой фазе и, как ожидается, сократить время уравновешивания и степень гипоксии. Микрожидкостных смешивания сети могут быть адаптированы к устройству, чтобы обеспечить средства для получения новых газовых смесей от нескольких танков газового сырья. Наконец, механизм обмена медиа устранило бы необходимость удаления устройства из пластины многоямного, из которых клетки могут реагировать.

Устройство имеет приложения в любой в пробирке или бывших естественных условиях эксперимента требующих контроля за концентрацией кислорода. Как кислород важных физиологических переменных, влияющих Подавляющее большинство сигнальных путей, направлений исследований, которые выиграют ограничивается творчество исследователя. Некоторые поля, которые выиграют от расширения временной контроль концентрации кислорода включают рак метастазы, апноэ во сне, и сердечной травмы реперфузия ишемия, среди многих других. Например, прерывистый гипоксии коррелирует с более инвазивного рака, upregulating число metastastis связанных генах относительно непрерывной гипоксии и нормоксии. Пространственное управление также важно, как кислород градиенты имеют решающее значение в развитии, печени зональности, лекарственная токсичность, и ниши стволовых клеток. Устройство представлено в этой статье пойдет на пользу ряда областей исследований, предоставляя системе с меньшим лаборатории след, относительно простой эксплуатационным требованиям, и гораздо больший контроль над воздействия кислорода к клеткам.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PDMS-Sylgard 184		Dow Corning
Planar FOXY sensor		Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Coated microscope slide
Gas regulator		Omega	FL-1472-G
Gas		Airgas	Custom mixes	All have 5% CO2
SU-8 2150		Microchem
MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine		SAFC Biosciences	M3803
Fetal Bovine Serum		ATCC	30-2020
Trypsin-EDTA		Sigma	T4049
L-Glutamine solution		Sigma	G7513