Tillverkning och drift av en Oxygen Insats för Vidhäftande cellodlingar

Summary

Tillverkning och validering av en add-on-plattform som erbjuder ökad kontroll över den rumsliga och tidsmässiga syresättning i en 6-brunnar. Enheten är anpassningsbar till ett antal kultur-system och kan användas för att undersöka effekterna av syrgas på sårläkning.

Abstract

Syre är en viktig modulator av många cellulära signalvägar, men nuvarande anordningar som möjliggör<em> In vitro</em> Syre modulering misslyckas med att möta behoven av biomedicinsk forskning. Den hypoxiska kammare är ett enkelt system för att kontrollera syresättningen i standard odlingskärl, men saknar precis tidsmässiga och geografiska kontroll över syrekoncentration på cellytan, vilket förhindrar dess tillämpning i att studera olika fysiologiska fenomen. Andra system har förbättrats på hypoxisk kammaren, men kräver specialiserad kunskap och utrustning för deras verksamhet, vilket gör dem skrämmande för den genomsnittlige forskaren. En mikrofabricerade insats för multispot plattor har utvecklats för att mer effektivt kontrollera den tidsmässiga och geografiska syrehalt för att bättre modell fysiologiska fann fenomen<em> In vivo</em>. Plattformen består av ett polydimetylsiloxan sätt att bygga bo i ett vanligt multispot plåt och fungerar som ett passivt mikroflödessystem gasnätet med en gas-membran som syftar till att modulera syre leverans till anhängare celler. Enheten är enkel att använda och är ansluten till gasflaskor som ger trycket att införa önskad syrehalten i plattformen. Tillverkning innebär en kombination av standard SU-8 fotolitografi, replika gjutning, och definieras PDMS spinning på en kiselskiva. Komponenterna i enheten är bundna efter ytbehandling med en handhållen plasma-system. Validering sker med en plan fluorescerande syresensor. Jämviktstiden är i storleksordningen minuter och ett brett utbud av syre profiler kan uppnås baserat på enheten konstruktionen, såsom den cykliska profil uppnåtts i denna studie, och även lutningar syre för att efterlikna de som finns<em> In vivo</em>. Enheten kan steriliseras för cellodling med hjälp av vanliga metoder utan förlust av funktion. Enhetens tillämplighet att studera<em> In vitro</em> Sårläkning svar kommer att demonstreras.

Protocol

1. Enhetens funktion Den hypoxiska sätter Enheten innehåller 6-pelare som häckar i ett vanligt 6-brunnar. Gas strömmar in i pelaren, över ett mikroflödessystem nätverk på basen av pelaren och rinner tillbaka ut ur enheten. Vid basen av pelaren som bildar botten vägg mikrokanalplatta är en 100 ìm tjock gas permeabla PDMS membran som tillåter syre diffusion mellan gas mikrokanalplatta och media kultur. Därför driver enheten genom inrättande av en koncentrationsgradient som driver media syrekoncentrationen mot ett önskat värde. Enheten erbjuder ett antal fördelar jämfört med hypoxisk kammaren och andra celler syrsättningssystem: 1) minimerar vägen syre diffusion tillåter snabbare världsliga kontroll, 2) förbättrar den fysiska kontrollen över syresättning, som beroende på pelaren mikrokanalplatta utformning, 3) har en mindre labb fotavtryck och högre genomströmning för att öka experimentella effektivitet, och 4) anpassar sig till gemensamma verktyg cellkultur (t.ex. multispot plåt) utan krav på specialkunskaper och utrustning. 2. Komponentframställning Första pelaren matrisen replik gjuten med PDMS i en tidigare bearbetad Delran mögel. Nästa gasen mikrokanalplatta längst ner på varje pelare är tillverkat med standard SU-8 fotolitografi och PDMS replika gjutning. Den gas-membran tillverkas genom att definieras spinning av PDMS på en kiselskiva att uppnå önskad tjocklek. I detta exempel använder vi en 100 ìm tjockt membran som tillverkas genom att snurra 500 rpm i 10 sekunder och sedan 900 rpm i 30 sekunder. Alla komponenter är bundna tillsammans efter syre plasma behandling med en handhållen plasma-enhet (Modell BD-20, Electro-Technic Products). 3. Enhetsinställningar För försiktigt in enheten i plattan och se till att undvika bubblor. Sportfisket enheten under införandet hjälper till att driva ut bubblorna ur ena sidan. För faktiska cellbaserade experiment, måste detta steg göras i en steril laminärt flöde huva. Chanserna för kontaminering kraftigt reduceras när enheten sätts in, så att församlingen kan föras över till inkubatorn i en icke-steril miljö. Anslut slangen från källan bensintanken till in-och utlopp portarna på enheten. För cellbaserade experiment bör kulturen inkubatorn har ett hål att tillåta slang inresa och slangen skall anslutas efter att enheten och placera den i inkubatorn. Var noga med att undvika att sätta övertryck på enheten, vilket kan deformera PDMS nog att krossa de underliggande cellerna. Se till att precisionen flödet regulatorn är stängd innan du öppnar regulatorn linne för att undvika överfyllda enheten. Starta flödet av gas. Öppna försiktigt precision flödesregulator till önskat flöde (50-100 ml / min). Titta på värdet noga under en timme och göra justeringar om det behövs, eftersom tryckfallet förändras medan systemet i jämvikt, ändra flödet. För att undvika bildning av bubblor i media, minska flödet till mellan 10-20 ml / min efter en inledande 15 minuter jämvikt tid med större flöde. Efter att ha önskat experimentella varaktighet, stoppa gasflödet, ta bort plattan, och bearbeta celler därefter (t.ex. Lyse, bets, räkna osv.) 4. Enhet Validering Kalibrering Välj antal och placering av positioner på självlysande syre (FOXY) sensor bild (beroende på validering krav) som kommer att användas för syre mätning. Bilden innehåller en fluorescerande beläggning rutenium färg som släcks av syre. Exponera bilden direkt till 0, 10, och 21% syre från bensintanken och ta bilder efter 5 minuter för korrekt jämvikt. Exportera medelvärdet bilden intensiteten för varje position och rita syresättning koncentration lika beroende av fluorescerande intensitet. Generera kalibreringskurva genom att montera linjära kurvor med 0-10% linjen och 10-21% linje. Heterogenitet Upprätta flera punkter som spänner över bredden på den kanal på ett definierat intervall (t.ex. var 1 mm). Observera att det kan finnas överlappning av bilder beroende på avståndet. Mät syrehalten vid brunnen ytan genom enheten Uppnå jämvikt Välj tre punkter på FOXY bilden där för att mäta syrehalten. Omedelbart efter att fånga en första bild på omgivande syrenivåer, öppna regulatorn precision flödet börja gasflödet till enheten. Ta bilder i ett lämpligt intervall för att bedöma varaktigheten och omfattningen av syre concentration jämvikt (t.ex. var 10 sekunder för 30 min). 5. Applikationer Sårvård En dag före försöket, blöt steriliseras PDMS in i serum-fria medel för att minska hämma bildningen gasbubbla i brunnen. Kultur celler till 100% confluency i en 6-brunnar. Skapa raka repor i monolager med en P200 pipettspets att simulera sår. Sug cellen media, skölj med 5 ml media och aspirera på nytt. Det är viktigt att inte störa monolager av celler. Fyll brunnarna med 4 mL serumfritt medel för att minska cellproliferation. Sätt in den i brunnar och ansluta varje brunn för att en motsvarande syrekoncentration. Placera 6-brunnar med insats på heta scenen vid 37 ° C. Ta bilder tid förflutit av celler vid önskat intervall och total längd. MATLAB är T_Scratch, ett sår som mäter algoritm kan användas för att analysera oläkta yta. 6. Representativa resultat Enhet validering Den hypoxiska sätter apparaten uppvisar stora förbättringar under de hypoxiska kammaren i form av syre jämviktstid och omfattning, vilket kräver mindre än 2 minuter att stabiliseras på 0,5% syre. Enheten membran-och botten spaltbredd var den kritiska faktorn som avgör jämvikt effektivitet, med större gap storlekar kräver mer tid för att uppnå steady-state värden syrehalten. Enheten tillåter även en stor del av kontrollen över den rumsliga syresättning i en enda väl, vilket gör att bildandet av flera villkor, och även generera en cyklisk syre profil över ytan av brunnen. Sårläkning Cell monolager utsattes för 10% eller 21% syre och ytan av såret analyserades med tiden. Repor utsätts för 21% syre stängs den långsammaste och 10% den snabbaste. Figur 1 visar bilder på en repa under loppet av 17 timmar. Diagrammen i figur 5 visar procent av öppet sår området för både syrehalter under hela experimentet. Figur 1. Schematisk och diagram illustrerar enhetens funktioner. Syret sätter Enheten tillverkas genom konventionell fotolitografi (mikroflödessystem nätverk), replika gjutning (mikroflödessystem nätverk och sätt schavotten), och definierade spinning av PDMS (gas-membran). A) Syret enhet kapslade in i en 6-brunnar. B) Exempel på 24-och 96-bra arrayer pelaren. C) En tvärsnittsstudie Schematisk bild av en pelare. Syre strömmar in i enheten via inlopp och färdas i mikroflödessystem nätverk på botten av pelaren. Syre kan fritt diffusa över gas permeabla PDMS membran i botten av pelaren och lös in i kulturen media. D) Ett mikroskop bild som visar de olika funktionerna i en enda kanal pelare från ovan, med limmade glas inlägg för jämvikt studier. Figur 2. Validering av enheten med syre sensorer. Syre spänningar inom varje brunn präglades med en plan rutenium syresensor. Alla syre blandningar innehöll balanserad kväve och 5% CO 2 för media buffring. A) Plotta illustrerar effekten av post höjd, och därmed syre diffusion avståndet mellan membran och celler, på jämviktstid och effektivitet. Heights fastställdes genom slipade inlägg bundna till undersidan av enheten. Alla tre inlägg storlekar ger jämvikt gånger förbättrats mycket under de hypoxisk kammare. Observera att tiden är på en stock skala. B) Plotta skildrar den snabba syre tiden jämvikt respons av 0,2 mm spalt enhet. C) med flera lägen linescans togs också över ordentligt under mikrokanalplatta att säkerställa homogenitet av syrekoncentrationen infördes genom enheten. Diagram skildrar syrehalten mäts efter infusion 0%, 10% och 21% syre i 10 min. D) Enheten upprätthåller ett effektivt sätt 10% syre under 5 dagar. Figur 3. Experiment med mer komplexa syre mikrokanalplatta design. A) Dual-tillstånd mikrokanalplatta installation ger en stabil 0% och 21% syre profil över 14 dagar. B) en interdigitated och slingrande mönster av 500 mikrokanaler ìm bredd som sträcker sig över the pelare resulterar i en cyklisk syre profil. Observera att uppgifterna endast skildrar en representant rättegång mikrokanalplatta anpassning var svårt. Figur 4. Timelapse bilder av sår 0, 7 och 17 timmar efter den första grunden. Celler levererades 21% syre under hela varaktigheten av experimentet. Figur 5. Effekter av syrgas på sårläkning ränta i en repa analys.

Discussion

Enheten är tillverkad av standard SU-8 fotolitografi, replika gjutning, och definierade spinning och helt i Polydimetylsiloxan. Gas införs i enheten att upprätta en koncentrationsgradient mellan pelare mikrokanalplatta och mediekultur, driver systemet mot en önskad jämvikt syrekoncentration. Enheten har visat sig effektivt modulera den tidsmässiga och geografiska syresättningen inne i en brunn, samt modulera cellulära beteende på lämpligt sätt. Den rumsliga mönstring av syresättning definieras av mikrokanalplatta vid basen av pelaren, så en mängd olika utföranden skulle kunna genomföras i crafting fotomasken. Dessutom är infusion av den önskade gas i gasfas av brunnen förväntas öka jämviktstid och omfattningen av hypoxi. Ett mikroflödessystem blandning nätverk skulle kunna anpassas till enheten för att ge möjlighet att producera nya gasblandningar från endast ett fåtal stridsvagnar lager gas. Slutligen skulle en mekanism för media utbyte eliminera behovet av borttagning av enheten från multispot plattan, där cellerna kan reagera.

Enheten har tillämpningar inom några in vitro eller ex vivo-experiment som kräver kontroll över syrehalten. Eftersom syre är en viktig fysiologisk variabel som påverkar en stor majoritet av signalvägar, är forskningsområden som skulle gynna begränsas av kreativitet av forskaren. Vissa fält som skulle dra nytta av den förbättrade temporala kontrollen av syrehalten inkluderar cancer metastasering, sömnapné och hjärt-ischemi reperfusion skador, bland många andra. Till exempel har intermittenta hypoxi varit korrelerade med mer invasiv cancer, upregulating ett antal metastastis-associerade gener i förhållande till kontinuerlig hypoxi och normoxia. Fysisk kontroll är också viktig, eftersom syre gradienter är avgörande för utvecklingen, lever zonindelning, läkemedelstoxicitet och stamceller nisch. Enheten presenteras i denna artikel kommer att gynna ett antal forskningsområden genom att tillhandahålla ett system med ett mindre labb fotavtryck, relativt enkla operativa krav, och långt större kontroll över syrgasexponeringen till celler.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PDMS-Sylgard 184		Dow Corning
Planar FOXY sensor		Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Coated microscope slide
Gas regulator		Omega	FL-1472-G
Gas		Airgas	Custom mixes	All have 5% CO2
SU-8 2150		Microchem
MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine		SAFC Biosciences	M3803
Fetal Bovine Serum		ATCC	30-2020
Trypsin-EDTA		Sigma	T4049
L-Glutamine solution		Sigma	G7513