İmalat ve Operasyon yapışkan Hücresel Kültürler Oksijen Ekle

Summary

6 plaka mekansal ve zamansal oksijenasyonu üzerinden gelişmiş kontrol imkanı sağlayan bir add-on bir platform imalatı ve doğrulama. Cihaz bir dizi kültür sistemleri uyarlanabilir ve yara iyileşmesi üzerine oksijen etkilerini araştırmak amacıyla kullanılabilir.

Abstract

Oksijen birçok hücresel yollar önemli bir modülatör, ancak mevcut cihazların izin<em> In vitro</em> Oksijen modülasyon biyomedikal araştırma ihtiyaçlarını karşılamak için başarısız olur. Hipoksik odasına standart kültür damarlarındaki oksijenlenme kontrol etmek için basit bir sistem sunuyor, ancak, fizyolojik olayların çeşitli eğitim uygulaması önlenmesi, hücre yüzeyinde bulunan oksijen konsantrasyonu üzerinde tam zamansal ve mekansal kontrol yoksun. Diğer sistemler hipoksik odasının üzerine geliştirilmiş, ancak kendi çalışması için özel bilgi ve ekipman gerektiren, ortalama araştırmacı için onları korkutucu hale getirir. Multiwell plakaları için microfabricated eklemek bulundu iyi model fizyolojik olgular için zamansal ve mekansal oksijen konsantrasyonu daha etkili bir şekilde kontrol etmek için geliştirilmiştir<em> In vivo</em>. Platformu, standart bir multiwell plakasına yuvaları ve pasif mikroakışkan amaçlayan bir gaz geçirgen bir zar ile gaz ağının olarak hizmet vermektedir yapışık hücrelere oksijen sunumunu modüle polidimetilsiloksan eklemek oluşur. Cihaz kullanımı kolay ve platform haline istenen oksijen konsantrasyonu tanıtmak basınç sağlayan gaz silindirleri bağlı. Fabrikasyon bir silikon yonga üzerinde iplik standart SU-8 fotolitografi, çoğaltma kalıplama, ve tanımlanmış PDMS bir kombinasyonu içerir. Cihazın bileşenleri, elde tutulan bir plazma sistemi kullanılarak yüzey tedaviden sonra yapıştırılır. Doğrulama düzlemsel floresan oksijen sensörü ile gerçekleştirilebilir. Dengelenme zamanı dakika sırasına ve oksijen profilleri geniş bir yelpazede bulunan bu taklit etmek için, bu çalışmada elde edilen siklik profili olarak cihaz tasarımı, ve hatta oksijen gradyanlar göre elde edilebilir<em> In vivo</em>. Cihaz fonksiyon kaybı olmadan ortak yöntemler kullanılarak hücre kültürü için sterilize edilebilir. Okuyan cihazın uygulanabilirliği<em> In vitro</em> Yara iyileşmesi tepki gösterdi.

Protocol

1. Cihaz işlevi Hipoksik eklemek cihaz 6-sütunlar içerdiğini standart 6-plaka içine yuva. Gaz direğinin dibinde mikroakışkan ağ üzerinden ayağı içine akar ve cihazın geri akar. Mikrokanallı alt duvarını oluşturan direği dibinde Mikrokanallı gaz ve kültür ortamı arasındaki oksijen difüzyon izinleri 100 mikron kalınlığında bir gaz geçirgen PDMS membran. Böylece, cihazın istenen değere doğru medya oksijen konsantrasyonu sürücüler bir konsantrasyon gradiyenti kurarak çalışır. Bir cihaz hipoksik odası ve diğer hücre oksijenasyonu sistemleri üzerinde bir dizi avantaj sunar: 1)) daha hızlı zamansal kontrol, 2 izin oksijen difüzyon yolu en aza indirir, ayağı Mikrokanallı tasarım, 3 bağlı oksijenasyon üzerinde mekansal kontrol) artırır sahip küçük bir laboratuvar ayak izi ve deneysel verimliliği artırmak için daha yüksek verim ve 4), özel bilgi ve ekipman için gereksinimi olmadan ortak hücre kültürü araçları (örneğin multiwell plaka) uyarlar. 2. Cihaz fabrikasyon İlk ayağı dizisi PDMS ile daha önce işlenmiş bir Delran kalıp kalıp kopyasıdır. Sonraki gaz her ayağı altındaki Mikrokanallı standart SU-8 fotolitografi ve PDMS çoğaltma kalıp kullanılarak imal edilir. Gaz geçirgen zar, istenilen kalınlığı elde etmek için bir silikon yonga üzerinde PDMS tanımlanan iplik üretilir. Bu örnekte 10 saniye için 500 rpm ve daha sonra 30 saniye süreyle 900 rpm dönen tarafından imal edilen 100 mikron kalınlığında bir membran kullanın. Tüm bileşenleri bir el plazma cihazı (Model BD-20, Elektro-Teknik Ürünler) ile oksijen plazma tedaviden sonra bir araya yapıştırılır. 3. Cihaz ayarları Yavaşça cihazın kabarcıkları önlemek için emin olun, plakası takın. Yerleştirilmesi sırasında cihazın bir tarafında kabarcıklar Olta sınırdışı etmeye yardımcı olur. Gerçek hücre tabanlı deneyler için, bu adımı steril bir laminer akış kaputu içinde yapılmalıdır. Cihazın takılı bir kez kirlenme şansı büyük ölçüde azalır, montaj inkübatör, steril olmayan bir ortamda yapılabilir. Boru kaynak gaz tankı cihazın giriş ve çıkış portlarına bağlayın. Hücre tabanlı deneyler için, kültür inkübatör boru giriş ve boru cihaz taşıma ve kuvöz içine yerleştirerek sonra bağlı olmalıdır izin verecek bir delik olmalıdır. Altta yatan hücreler ezmek için yeterli PDMS deforme cihazı, aşırı basınç koyarak önlemek için dikkatli olun. Hassas akış regülatörü, cihaz taşan önlemek için tank top regülatörü açmadan önce kapalı olduğundan emin olun. Gaz akışını başlatın. Istenen akış hızı (50-100 ml / dk) hafifçe açık hassas akış regülatörü. Basınç düşüşü akış hızını değiştirerek sistemi, equilibrates değişecek, bir sonraki saatten fazla değer yakından izlemek ve gerekli değişiklikleri yapmak. Medya kabarcıklarının oluşumunu önlemek için, yüksek debili bir ilk 15 dakika dengelenme süresi sonra 10-20 arasında ml / dk akış hızını azaltır. Istenilen deneme süresinden sonra, gaz akışını durdurmak, plaka kaldırmak ve süreç hücrelerin buna göre (örneğin, vb, sayım, leke, lyse). 4. Aygıt Doğrulama Ayarlama Floresan oksijen pozisyonların sayısı ve konumu seçin. (FOXY) oksijen ölçümü için kullanılan sensör slayt (doğrulama gereksinimlerine göre). Slayt oksijen ile söndürülür floresan Rutenyum boya kaplama içerir. 0, 10 slayt Açığa ve doğrudan gaz tankeri,% 21 oksijen ve düzgün dengelenmesi için 5 dakika sonra görüntüleri yakalayabilir. Floresan yoğunluğuna bağlı olarak her bir pozisyon ve arsa oksijenasyonu konsantrasyonu ortalama görüntü yoğunluğu ihracat. % 0-10 çizgisine uyan doğrusal eğrileri ve 10-21% hattı kalibrasyon eğrisi oluşturun. Heterojenite Belirli bir aralığı (örneğin her 1 mm) kanal genişliği kapsayan birden çok nokta oluşturulması. Boşluğu bağlı olarak görüntüleri üst üste olabileceğini unutmayın. Cihaz üzerinden iyi yüzey oksijen konsantrasyonu ölçün Dengeleme Oksijen konsantrasyonu ölçmek için üç puan FOXY slayt seçin. Ortam oksijen seviyesi ilk fotoğraf çekiminden hemen sonra, cihazın içine gaz akışını başlatmak için hassas akış regülatörü açın. Oksijen Concentr süresi ve kapsamı değerlendirmek için uygun bir aralıkta görüntüler yakalayınation dengeleme (örneğin her 10 saniyede bir 30 dakika). 5. Uygulamalar Yara İyileşmesi Deneyden önce bir gün serum orta, iyi gaz kabarcık oluşumunu engellediğini azaltmak için sterilize PDMS eklemek bekletin. 6 plaka% 100 confluency Kültür hücreleri. Yaralar simüle etmek için bir P200 pipet ile mono tabakaları düz çizikler oluşturun. Hücre aspire medya, 5 ml medya ile temizleyin, durulayın ve tekrar aspire. Hücrelerin tek tabaka rahatsız değil önemlidir. Yedek hücre proliferasyonu azaltmak için 4 ml serum orta kuyular. Place kuyuların içine yerleştirin ve karşılık gelen bir oksijen konsantrasyonu her iyi bağlamak. 37 ısıtılmış sahnede eki ile birlikte koyun 6-plaka ° C Istenen aralık ve toplam süresi hücrelerinin zaman atlamalı görüntüleri yakalayın. MATLAB T_Scratch, bir yara ölçüm algoritması, iyileşmeyen yüzey alanı analiz etmek için kullanılır. 6. Temsilcisi Sonuçlar Cihaz doğrulama Hipoksik eklemek cihaz,% 0.5 oksijen stabilize etmek için en az 2 dakika gerektiren, oksijen dengeleme zamanı ve kapsamı açısından hipoksik odasının içinde büyük gelişmeler sergilemektedir. Cihazın membran kuyu alt boşluğu boyutu, daha büyük boşluk boyutları kararlı durum oksijen konsantrasyonu değerlerine ulaşmak için daha fazla zaman gerektiren, dengeleme verimliliği belirleyen en kritik faktör oldu. Cihaz, aynı zamanda birden fazla koşul oluşumuna izin, tek bir kuyuda mekansal oksijenasyonu büyük bir anlaşma üzerinde kontrol izin verir, ve hatta iyi bir yüzey üzerinde döngüsel bir oksijen profili oluşturmak. Yara iyileşmesi % 10 veya% 21 oksijen ve yara yüzey alanı hücre mono tabakaları maruz kaldılar zamanla analiz edildi. % 21 oksijene maruz çizikler yavaş ve% 10 hızlı kapattı. Şekil 1, 17 saat boyunca bir çizik görüntüleri gösterir. Şekil 5 grafikler, açık yara alan deney süresi boyunca her iki oksijen konsantrasyonları için yüzde göstermektedir. Şekil 1 şematik ve cihaz özellikleri gösteren diyagramları. Oksijen eklemek cihaz geleneksel fotolitografi (mikroakışkan network), çoğaltma kalıplama (mikroakışkan ağ ve insert iskele) tarafından imal ve (gaz geçirgen zar) PDMS iplik tanımlanır. A) oksijen cihazı 6 plaka iç içe. B) 24 ve 96-kuyu direği dizileri örnekleri. C) bir ayağı çapraz-kesitsel şematik. Oksijen giriş üzerinden cihazın içine akar ve ayağı altındaki mikroakışkan bir ağ üzerinden geçecek. Oksijen, gaz geçirgen PDMS membrandan serbestçe direğinin altındaki diffüz ve kültür ortamı içine çözülür. D) dengeleme çalışmaları için gümrüklü cam Mesajları, üstten tek kanallı bir sütun çeşitli özellikler gösteren bir mikroskop görüntüsü. Şekil 2 oksijen sensörleri ile cihazın Doğrulama. Oksijen basıncı her bir kuyunun içinde bir düzlemsel rutenyum oksijen sensörü kullanılarak karakterize edilmiştir. Tüm oksijen karışımları medya tamponlama için dengeli azot ve% 5 CO 2 içeriyordu. A) Denge süresi ve etkinliği üzerinde Arsa yazılan yüksekliğinin etkisi gösteren ve böylece membran ve hücreleri arasındaki oksijen difüzyon mesafesi. Heights cihazın altına bağlı kesme cam Mesajları kuruldu. Her üç yazılan boyutları verim dengeleme kez hipoksik odasının içinde çok geliştirdi. Zaman bir günlük ölçekte olduğunu unutmayın. B) Arsa hızlı oksijen dengeleme tepki süresi 0,2 mm boşluk cihazın tasvir. C) Çok konumlu linescans da Mikrokanallı altında iyi genelinde cihaz tarafından tanıtılan oksijen konsantrasyonu homojenliği sağlamak için alınmıştır. Grafik,% 0,% 10, ve 10 dakika süreyle% 21 oranında oksijen beslerken sonra ölçülen oksijen konsantrasyonu gösteriyor. D) Cihaz, 5 gün boyunca etkili% 10 oksijen korur. Şekil 3, daha karmaşık oksijen Mikrokanallı tasarımları ile denemeleri . A) Çift koşulu Mikrokanallı kurulum, istikrarlı bir% 0 ve 14 gün içinde% 21 oksijen profili verir. B) 500 mikron genişlik mikro bir interdigitated ve sarma desen inci boyunca uzanandöngüsel bir oksijen profili e ayağı sonuçlanır. Mikrokanallı hizalama zor olduğu gibi veriler sadece bir temsilci deneme gösteriyor. Şekil 4 yaranın kapanması 0, 7, ve 17 saat sonra ilk sıfırdan Timelapse görüntüler. Hücreler Deney süresi boyunca% 21 oksijen teslim edildi. Şekil 5, oksijen konsantrasyonu üzerinde bir çizik tayininde yara iyileşmesi oranı etkisi .

Discussion

SU-8 standart fotolitografi çoğaltma kalıplama, ve iplik ve polidimetilsiloksan tamamen tanımlanan cihaz tarafından imal. Gaz, istenen denge oksijen konsantrasyonu doğru sistem, sürüş Mikrokanallı ayağı ve kültür ortamı arasında konsantrasyon farkı kurmak için cihazın içine tanıtıldı. Cihaz, bir kuyu içinde zamansal ve mekansal oksijenasyonu modüle, yanı sıra uygun bir şekilde hücresel davranışı modüle gösterilmiştir. Oksijenasyon mekansal desenlendirme direğinin dibinde Mikrokanallı tarafından tanımlanan, çeşitli tasarımlar photomask işçiliği uygulanan olabilir. Ayrıca, iyi gaz fazına istenen gaz infüzyon, dengeleme zamanı ve kapsamı hipoksi geliştirmek için bekleniyor. Mikroakışkan karıştırma ağ sadece birkaç stok gaz tankları roman gaz karışımları üretmek için bir araç sağlamak için cihaza adapte olabilir. Son olarak, medya değişimi için bir mekanizma hücreleri yanıt verebilir multiwell plaka, cihazın çıkarılması için ihtiyaç ortadan kaldıracaktır.

Cihaz in vitro veya ex vivo deneyi oksijen konsantrasyonu üzerinde kontrol gerektiren herhangi bir uygulamalar vardır. Oksijen sinyal yolları büyük bir çoğunluğu etkileyen önemli bir fizyolojik değişken olduğundan, yararlanacak araştırma alanlarında araştırmacı yaratıcılığı ile sınırlıdır. Diğerleri arasında kanser metastazı, uyku apnesi ve kardiyak iskemi reperfüzyon hasarı, oksijen konsantrasyonu gelişmiş temporal kontrolü yararlanacak bazı alanlar şunlardır. Örneğin, aralıklı hipoksi sürekli hipoksi ve normoxia göre metastastis ilişkili genlerin bir dizi upregulating, daha invaziv kanserler ile ilişkili. Mekansal kontrolü oksijen gradyanlar geliştirme, karaciğer zonation, ilaç zehirlenmesi, ve kök hücre niş kritik olduğu gibi, aynı zamanda önemlidir. Bu makalede sunulan cihaz, bir sistem, daha küçük bir laboratuvar ayak izi, nispeten basit operasyonel gereksinimleri ve hücrelere oksijen aşırı maruz kalmak çok daha fazla kontrol sağlayarak araştırma alanlarında bir dizi fayda sağlayacaktır.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PDMS-Sylgard 184		Dow Corning
Planar FOXY sensor		Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Coated microscope slide
Gas regulator		Omega	FL-1472-G
Gas		Airgas	Custom mixes	All have 5% CO2
SU-8 2150		Microchem
MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine		SAFC Biosciences	M3803
Fetal Bovine Serum		ATCC	30-2020
Trypsin-EDTA		Sigma	T4049
L-Glutamine solution		Sigma	G7513