MITO permite la detección sensible de las interacciones transitoria y estable entre las proteínas que se expresan en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae. Se ha aplicado con éxito para estudiar las proteínas integrales de membrana exógenos y la levadura con el fin de identificar a sus socios que interactúan de un modo de alto rendimiento.
La importancia biológica fundamental y clínica de las proteínas integrales de membrana impulsado el desarrollo de un sistema a base de levadura para la identificación de alto rendimiento de las interacciones proteína-proteína (PPI) para las proteínas transmembrana de larga duración. Con este fin, nuestro laboratorio desarrolló la levadura split-ubiquitina membrana base de dos híbridos (MITO) del sistema. Esta tecnología permite la detección sensible de las interacciones proteína transitoria y estable con<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Como un organismo huésped. MITO se aprovecha de la observación de que la ubiquitina se pueden separar en dos mitades estable: la mitad C-terminal de la levadura ubiquitina (C<sub> Ub</sub>) Y la mitad N-terminal de la fracción de ubiquitina (N<sub> Ub</sub>). En el mito, este principio se ha adaptado para su uso como un "sensor" de las interacciones proteína-proteína. En pocas palabras, la proteína de membrana integral cebo se funde con C<sub> Ub</sub> Que está relacionado con un factor de transcripción artificiales. Presa proteínas, ya sea en formato individual o de la biblioteca, se fusionan a la N<sub> Ub</sub> Mitad. La interacción entre la proteína cebo y la presa conduce a la reconstitución de los restos de la ubiquitina, formando una larga duración 'pseudo-ubiquitina "molécula. Esta molécula es a su vez reconocida por las enzimas citosólicas deubiquitinating, dando como resultado la escisión del factor de transcripción, y la posterior inducción de la expresión del gen. El sistema es muy adaptable, y está particularmente bien adaptado a la selección de alto rendimiento. Se ha empleado con éxito para investigar las interacciones con las proteínas integrales de membrana a partir de levaduras y otros organismos.
Mito es el primer sistema de alto rendimiento que permite la identificación de las interacciones entre las proteínas de membrana de larga duración y citosólica o socios de la membrana. Se ha utilizado para estudiar la proteína de la membrana de una serie de organismos [3-7]. Hay, sin embargo, los detalles específicos que deben ser examinados para asegurar que la proteína de interés puede ser objeto de estudio con el mito.
Muchas proteínas de membrana se dirigen a la membrana plasmá…
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría dar las gracias a Edmonds amanecer para una lectura crítica de este manuscrito. El laboratorio Stagljar es apoyado por fondos de la Fundación Canadiense para la Innovación (CFI), el Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR), la Fundación Heart and Stroke, de la Sociedad Canadiense del Cáncer y Novartis.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Polyethenlene Glycol (PEG3350) | Bioshop | PEG335 | ||
Lithium Acetate Bihydrate | Bioshop | LIA001 | ||
X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | Bioshop | XGA001 | ||
N`,N-dimethyl formamide | Bioshop | DMF 451 | ||
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Bioshop | ATT124 | ||
Sodium phosphate dibasic | Bioshop | SPD307 | ||
Sodium phosphate monobasic | FisherBiotech | BP329-500 | ||
Salmon Sperm DNA | VWR | CA80601-120 | ||
D-Glucose | Bioshop | GLU501 | ||
LB Broth LENOX | Bioshop | LBL405 | ||
Yeast Nitrogen Base | Bioshop | YNB406 | ||
Yeast Extract | Bioshop | YEX401 | ||
Peptone | Beckton Dickinson | 211677 | ||
Bio-Tryptone | Bioshop | TRP402 | ||
Adenine Sulphate | Bioshop | ADS201 | ||
L-Uracil | Bioshop | URA241 | ||
L-Threonine | Bioshop | THR002 | ||
L-Histidine | Bioshop | HIS200 | ||
L-Methionine | Bioshop | MET222 | ||
L-Valine | Bioshop | VAL201 | ||
L-Phenylalanine | Bioshop | PHA302 | ||
L-Isoleucine | Bioshop | ISO910 | ||
L-Tyrosine | Bioshop | TYR333 | ||
L-Leucine | Bioshop | LEU222 | ||
L-Arginine | Bioshop | ARG006 | ||
L-Tryptophane | FisherBiotech | BP395-100 | ||
L-Lysine | Bioshop | LYS101 | ||
L-Alanine | FisherBiotech | BP369-100 | ||
Agar | Bioshop | AGR001 | ||
Soda Lime Galss Beads | BioSpec Product | 11079105 | ||
Sodium Chloride | Bioshop | SLD002 |