Undecalcified Bone Voorbereiding voor Histologie, histomorfometrie en fluorchroom Analyse
Summary
Undecalcified bot histologie levert belangrijke informatie voor een verscheidenheid aan klinische en wetenschappelijke toepassingen. Het is technisch uitdagend, met name bij grote afmetingen exemplaren. Deze video illustreert het proces van het produceren van een goede kwaliteit onderdelen en demonstreert de technische problemen en methoden waarmee ze te overwinnen.
Abstract
Undecalcified bot histologie demonstreert de micro-architectuur van het bot. Het toont zowel de gemineraliseerde en cellulaire componenten van het bot, dat vitale informatie over botmetabolisme of botvorming en botresorptie biedt. Dit heeft een enorme betekenis in een verscheidenheid van klinische en wetenschappelijke toepassingen. Het levert prachtige beelden 1 en staat voor technieken zoals fluorochroom beoordeling en histomorfometrie 2. Fluorochroom analyse is een techniek waarbij fluorescerende kleurstoffen die zich binden aan calcium worden geïnjecteerd op een bepaald tijdstip, dat voor het kwantificeren van de hoeveelheid mineralisatie kan op dat gegeven moment. Histomorfometrie is een proces van bot kwantificering op microscopisch niveau.
Het uitvoeren van undecalcified bot histologie is technisch uitdagend, met name bij grote afmetingen exemplaren. Het vereist variaties in de techniek uit die worden gebruikt in standaard paraffine ingebed histologie. Deze video illustreert het proces van het produceren van een goede kwaliteit onderdelen en demonstreert de technische problemen en methoden waarmee ze te overwinnen. Prepareren, fixatie en verwerking worden bereikt met een manier die vergelijkbaar is met andere zachte weefsels, maar door de dichtheid en de lagere permeabiliteit van het bot aanzienlijk langer fixatie en doorlooptijden nodig zijn, vaak het nemen van enkele weken. Inbedding is bereikt met behulp van een ondersteunende medium met soortgelijke of gelijk zijn hardheid en de dichtheid tot op het bot, zoals methacrylaat gebaseerde harsen, maar in tegenstelling tot paraffine infiltratie en inbedding, dit is een onomkeerbare stap. Snijden kan worden bereikt door slijpen die produceert een dikkere deel, dat optimaal is voor studies, zoals fluorchroom analyse. Dit wordt het best bereikt met behulp van een diamant blad op een macrotome. Als alternatief kunnen dunnere gedeelten worden geproduceerd voor lichtmicroscopie en dit is bereikt met behulp van een slede microtoom met een zeer scherp mes. De slee microtoom zorgt voor de extra kracht en stabiliteit die nodig is voor grote, harde blokken. Hars ingebedde coupes kunnen worden gekleurd met een verscheidenheid van vlekken, die zijn aangetoond.
Protocol
Acknowledgements
De auteurs willen graag de hulp van mevrouw Sue Connell erkennen voor haar expertise in hars inbedding en mevrouw Stephania Graven voor haar laboratorium-expertise. De auteurs willen graag professor Frank Kandziora en dr. Marie-Anne Polboth bedanken voor hun advies.
Materials
- 10% Normal Buffered Formalin, Ethanol, Xylene and Butanol acid
All histology grade, sulfur free.
Grale Scientific Pty Ltd.
http://www.grale.com.au
- Peel away, plastic moulds
Grale Scientific
- SUPERFROST PLUS Microscope slides
Lomb Scientific Pty Ltd.
http://www.lomb.com.au
- GlycolMethacrylate Technovit 7100
Heraeus Kulzer
http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm - Backing Block Resin- Technovit 3040 Histo block
Heraeus Kulzer
(Reagents from Grale Scientific)
Goldner’s Trichrome stain
1. Weigert’s iron hemotoxylin (DeGroat)
| a) Hemotoxylin solution | |
| Hemotoxylin | 1g |
| Absolute Alcohol | 100mL |
| b) Iron Solution | |
| 30% aqueous ferric chloride | 4mL |
| Hydrochloric acid (concentrated) | 1mL |
| distilled Water | 95mL |
Filtered and added to equal volume of hemotoxylin immediately before stain used.
2. Ponceau-fuchsin-azophloxin stock solutions
| a) Ponceau de xylidine solution | |
| Ponceau de xylidine | 0.75g |
| acid fuchsion | 0.25g |
| Acetic Acid | 1mL |
| mix, and add distilled water (100mL) | |
| b) azophloxin solution | |
| Azophloxin | 0.5g |
| Acetic acid | 0.6mL |
| mix, and add distilled water (100mL) | |
| c) Final working stain solution | |
| Ponceau-fuchsin solution | 5-10mL |
| Azophloxin | 2mL |
| 0.2% acetic acid solution | 88mL |
3. Light Green Solution
| Light Green | 1g |
| acetic acid | 1mL |
| Mix, and add distilled water (500mL) | |
4. Phophomolybdic acid-Orange G solution
| Phosphomolybdic acid | 3g |
| Orange G | 2g |
| Dissolve in 500mL of distilled water and add crystal thymol. | |
Von Kossa Stain
| 1% aqueous silver nitrate |
| 2.5% sodium thiosulfate |
| 1% safranin O |
Alcian blue stain
| Alcian blue 8GX | 1g |
| 3% acetic acid solution | 100mL |
Hemotoxylin and Eosin stain
| a)Harris’s hemotoxylin | |
| Hemotoxylin | 2.5g |
| Absolute alcohol | 25mL |
| Potassium Alum | 50g |
| distilled water | 500mL |
| mercuric oxide | 1.25g OR |
| Sodium iodate | 0.5g |
| Glacial acetic acid | 20mL |
| b) Eosin solution | |
| Commercially produced Eosin was used. | |
All stain dye powders are Gurr dye powders.
All reagents are analytical reagents, and not Lab reagents
Fluorochromes
Manufacturer |
Fluorochrome | Catalogue Number |
| Sigma-Aldrich, Sydney | Calcein Green | C0875 |
| Sigma-Aldrich, Sydney | Alizarin Complexone | A3882 |
| Intervet Australia, Victoria | Oxytetracycline (off the shelf antimicrobial drug) |
Tradename; Engemycin 100 |
References
- Kerr, J. . Atlas of Functional Histology. , 164-168 (2000).
- Parfitt, A. M. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).
- An, Y. H., Martin, K. l. . Handbook of histology methods for bone and cartilage. , (2003).
- Bancroft, J. D., Gamble, M. . Theory and Practice of Histological Techniques. , 352-360 (2008).
