Préparation des os décalcifiés pour l'histologie, histomorphométrie et analyse Fluorochrome

Summary

Histologie osseuse décalcifiés fournit des informations importantes pour une variété d'applications cliniques et de recherche. Il est techniquement difficile, en particulier avec des spécimens de grande taille. Cette vidéo illustre le processus de production de sections de bonne qualité et démontre les difficultés techniques et des méthodes permettant de les surmonter.

Abstract

Histologie osseuse décalcifiés démontre la micro-architecture du tissu osseux. Il montre à la fois les composants minéralisés et cellulaires de l'os, qui fournit des informations vitales sur le remodelage osseux ou de la formation et la résorption osseuse. Cela a une importance énorme dans une variété d'applications cliniques et de recherche. Il donne de belles images ¹ et permet de techniques comme l'évaluation et l'histomorphométrie fluorochrome ^2. Analyse fluorochrome est une technique où les colorants fluorescents qui se lient au calcium sont injectés à un point de moment particulier, qui permet de quantifier la quantité de minéralisation à ce moment donné. Histomorphométrie est un processus de quantification des os au niveau microscopique.

Exécution histologie osseuse décalcifiés est techniquement difficile, en particulier avec des spécimens de grande taille. Elle exige des variations dans la technique de celles utilisées dans de la paraffine Embedded Standard histologie. Cette vidéo illustre le processus de production de sections de bonne qualité et démontre les difficultés techniques et des méthodes permettant de les surmonter. Préparation de l'échantillon, la fixation et le traitement sont réalisés avec une manière similaire à d'autres tissus mous, mais en raison de la densité et la faible perméabilité de l'os considérablement plus longue de fixation et de délais de traitement sont nécessaires, prenant souvent plusieurs semaines. Embedding est réalisé en utilisant un milieu de support avec une dureté semblable ou égal et la densité de l'os comme le méthacrylate de résines à base de mais, contrairement à l'infiltration de paraffine et d'enrobage, il s'agit d'une étape irréversible. Sectionnement peut être réalisé par broyage qui produit une section plus épaisse, ce qui est optimal pour les études telles que l'analyse fluorochrome. Le mieux est réalisé en utilisant une lame de diamant sur une macrotome. Alternativement, des sections plus minces peuvent être produites pour la microscopie optique et ceci est réalisé à l'aide d'un microtome luge avec une lame très aiguisée. Le microtome luge fournit la force supplémentaire et la stabilité requises pour les grands, les blocs durs. Résine sections intégrées peuvent être colorés avec une variété de taches, qui sont démontrés.

Protocol

1. Le tissu est placé dans un récipient scellé contenant du phosphate tamponnée à 10% une solution de formol ^3. Assurer une exposition minimale à la lumière, si l'analyse fluorochrome doit être exécuté, comme les fluorochromes sont sensibles à la lumière.
2. Établir dont l'orientation du tissu sera nécessaire.
3. Coupez le spécimen à la taille, l'orientation correcte, en utilisant une scie à ruban. Mesures de sécurité Assurez-vous sont respectées. L'échantillon est ensuite placé dans un récipient opaque, dont le volume devrait être d'environ dix fois la taille de l'échantillon pour obtenir une fixation adéquate. Le spécimen doit rester d....

Materials

a) Solution Hemotoxylin
Hemotoxylin	1g
Alcool absolu	100mL
b) Solution de fer
Aqueuse à 30% de chlorure ferrique	4mL
L'acide chlorhydrique (concentré)	1ml
Eau distillée	95ml

a) Ponceau de xylidine solution
Ponceau de xylidine	0,75 g
fuchsion l'acide	0.25g
Acide acétique	1ml
mélanger l'eau, et ajouter distillée (100 ml)
b) une solution azophloxin
Azophloxin	0.5g
L'acide acétique	0.6ml
mélanger l'eau, et ajouter distillée (100 ml)
c) travail final solution de coloration
Ponceau-solution de fuchsine	5-10ml
Azophloxin	2mL
0,2% de solution d'acide acétique	88mL

Green Light	1g
l'acide acétique	1ml
Mélanger et ajouter de l'eau distillée (500 ml)

L'acide phosphomolybdique	3g
Orange G	2g
Dissoudre dans 500 ml d'eau distillée et ajouter le thymol cristal.

1% de nitrate d'argent aqueuse

Thiosulfate de sodium à 2,5%

1% de safranine O

Bleu Alcian 8GX	1g
3% de solution d'acide acétique	100mL

a) de Harris hemotoxylin
Hemotoxylin	2.5g
L'alcool absolu	25mL
Alun de potassium	50g
l'eau distillée	500mL
l'oxyde de mercure	1,25 g OU
Iodate de sodium	0.5g
L'acide acétique glacial	20mL
b) une solution d'éosine
Eosine produit commercialement a été utilisé.

Fabricant	Fluorochrome	Numéro de catalogue
Sigma-Aldrich, Sydney	Calcéine verte	C0875
Sigma-Aldrich, Sydney	Alizarine complexone	A3882
Intervet Australie, Victoria	Oxytétracycline (Hors médicaments antimicrobiens étagères)	Nom commercial; Engemycin 100