Undecalcified ben histologi innehåller viktig information för en rad olika kliniska och forskningsansökningar. Det är tekniskt utmanande, särskilt med stora exemplar. Denna video visar hur processen för att producera bra kvalitet sektioner och visar på tekniska svårigheter och metoder som man kan övervinna dem.
Undecalcified ben histologi visar mikro-arkitektur ben. Det visar både den mineraliserade och cellulära komponenter av ben, som ger viktig information på benomsättning eller benbildning och benresorption. Detta har enorm betydelse i olika kliniska och forskningsansökningar. Det ger vackra bilder 1 och tillåter tekniker såsom fluorokrom bedömning och histomorphometry 2. Fluorokrom analys är en teknik där fluorescerande färger som binder till kalcium injiceras vid en viss tidpunkt, vilket möjliggör kvantifiering av mängden mineraliseringen vid denna tid. Histomorphometry är en process av ben kvantifiering på mikroskopisk nivå.
Utföra undecalcified ben histologi är tekniskt utmanande, särskilt med stora exemplar. Det kräver variationer i tekniken från dem som används i standard paraffininbäddad histologi. Denna video visar hur processen för att producera bra kvalitet sektioner och visar på tekniska svårigheter och metoder som man kan övervinna dem. Provberedning, fixering och bearbetning uppnås med ett liknande sätt som andra mjuka vävnader, men på grund av densitet och lägre permeabilitet av ben betydligt längre fixering och handläggningstider krävs ofta tar flera veckor. Inbäddning sker med hjälp av en stödjande medium med liknande eller samma hårdhet och täthet till benet som metakrylatbaserade hartser, men till skillnad från paraffin infiltration och bädda, detta är ett oåterkalleligt steg. Sektionering kan uppnås genom slipning som ger en tjockare del, som är optimal för studier som fluorokrom analys. Detta uppnås bäst med hjälp av en diamantklinga på en macrotome. Alternativt kan tunnare tas fram för ljusmikroskopi och detta uppnås med hjälp av en släde mikrotom med en mycket vass kniv. Släden mikrotom ger ytterligare styrka och stabilitet som krävs för stora, hårda block. Resin inbäddade sektioner kan färgas med olika fläckar, som demonstreras.
Författarna vill tacka för stöd av fru Sue Connell för sin expertis i harts inbäddning och Ms Stephania Tombs för hennes laboratorium expertis. Författarna vill tacka Professor Frank Kandziora och dr Marie-Anne Polboth för sina råd.
Goldner’s Trichrome stain
1. Weigert’s iron hemotoxylin (DeGroat)
a) Hemotoxylin solution | |
Hemotoxylin | 1g |
Absolute Alcohol | 100mL |
b) Iron Solution | |
30% aqueous ferric chloride | 4mL |
Hydrochloric acid (concentrated) | 1mL |
distilled Water | 95mL |
Filtered and added to equal volume of hemotoxylin immediately before stain used.
2. Ponceau-fuchsin-azophloxin stock solutions
a) Ponceau de xylidine solution | |
Ponceau de xylidine | 0.75g |
acid fuchsion | 0.25g |
Acetic Acid | 1mL |
mix, and add distilled water (100mL) | |
b) azophloxin solution | |
Azophloxin | 0.5g |
Acetic acid | 0.6mL |
mix, and add distilled water (100mL) | |
c) Final working stain solution | |
Ponceau-fuchsin solution | 5-10mL |
Azophloxin | 2mL |
0.2% acetic acid solution | 88mL |
3. Light Green Solution
Light Green | 1g |
acetic acid | 1mL |
Mix, and add distilled water (500mL) |
4. Phophomolybdic acid-Orange G solution
Phosphomolybdic acid | 3g |
Orange G | 2g |
Dissolve in 500mL of distilled water and add crystal thymol. |
Von Kossa Stain
1% aqueous silver nitrate |
2.5% sodium thiosulfate |
1% safranin O |
Alcian blue stain
Alcian blue 8GX | 1g |
3% acetic acid solution | 100mL |
Hemotoxylin and Eosin stain
a)Harris’s hemotoxylin | |
Hemotoxylin | 2.5g |
Absolute alcohol | 25mL |
Potassium Alum | 50g |
distilled water | 500mL |
mercuric oxide | 1.25g OR |
Sodium iodate | 0.5g |
Glacial acetic acid | 20mL |
b) Eosin solution | |
Commercially produced Eosin was used. |
All stain dye powders are Gurr dye powders.
All reagents are analytical reagents, and not Lab reagents
Fluorochromes
Manufacturer |
Fluorochrome | Catalogue Number |
Sigma-Aldrich, Sydney | Calcein Green | C0875 |
Sigma-Aldrich, Sydney | Alizarin Complexone | A3882 |
Intervet Australia, Victoria | Oxytetracycline (off the shelf antimicrobial drug) |
Tradename; Engemycin 100 |