Undecalcified Bone Förberedelse för histologi, Histomorphometry och fluorokrom Analys

Summary

Undecalcified ben histologi innehåller viktig information för en rad olika kliniska och forskningsansökningar. Det är tekniskt utmanande, särskilt med stora exemplar. Denna video visar hur processen för att producera bra kvalitet sektioner och visar på tekniska svårigheter och metoder som man kan övervinna dem.

Abstract

Undecalcified ben histologi visar mikro-arkitektur ben. Det visar både den mineraliserade och cellulära komponenter av ben, som ger viktig information på benomsättning eller benbildning och benresorption. Detta har enorm betydelse i olika kliniska och forskningsansökningar. Det ger vackra bilder ¹ och tillåter tekniker såsom fluorokrom bedömning och histomorphometry ^2. Fluorokrom analys är en teknik där fluorescerande färger som binder till kalcium injiceras vid en viss tidpunkt, vilket möjliggör kvantifiering av mängden mineraliseringen vid denna tid. Histomorphometry är en process av ben kvantifiering på mikroskopisk nivå.

Utföra undecalcified ben histologi är tekniskt utmanande, särskilt med stora exemplar. Det kräver variationer i tekniken från dem som används i standard paraffininbäddad histologi. Denna video visar hur processen för att producera bra kvalitet sektioner och visar på tekniska svårigheter och metoder som man kan övervinna dem. Provberedning, fixering och bearbetning uppnås med ett liknande sätt som andra mjuka vävnader, men på grund av densitet och lägre permeabilitet av ben betydligt längre fixering och handläggningstider krävs ofta tar flera veckor. Inbäddning sker med hjälp av en stödjande medium med liknande eller samma hårdhet och täthet till benet som metakrylatbaserade hartser, men till skillnad från paraffin infiltration och bädda, detta är ett oåterkalleligt steg. Sektionering kan uppnås genom slipning som ger en tjockare del, som är optimal för studier som fluorokrom analys. Detta uppnås bäst med hjälp av en diamantklinga på en macrotome. Alternativt kan tunnare tas fram för ljusmikroskopi och detta uppnås med hjälp av en släde mikrotom med en mycket vass kniv. Släden mikrotom ger ytterligare styrka och stabilitet som krävs för stora, hårda block. Resin inbäddade sektioner kan färgas med olika fläckar, som demonstreras.

Protocol

Vävnaden placeras i en sluten behållare som innehåller 10% fosfatbuffrad formalin lösning 3. Säkerställa minimal exponering för ljus, om fluorokrom analys skall utföras, eftersom fluorokromer är ljuskänsliga. Fastställa vilka orientering av vävnad kommer att krävas. Trimma provet storlek, i rätt riktning, med hjälp av en bandsåg. Se till att säkerhetsåtgärder följs. Provet sedan placeras i en genomskinlig behållare, bör vars volym vara cirka tio gånger storleken av provet för att u…

Materials

Solvents:

• 10% Normal Buffered Formalin, Ethanol, Xylene and Butanol acid
  All histology grade, sulfur free.
  Grale Scientific Pty Ltd.
  http://www.grale.com.au

Moulds:

• Peel away, plastic moulds
  Grale Scientific

Slides:

• SUPERFROST PLUS Microscope slides
  Lomb Scientific Pty Ltd.
  http://www.lomb.com.au

Resin:

• GlycolMethacrylate Technovit 7100
  Heraeus Kulzer
  http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm
• Backing Block Resin- Technovit 3040 Histo block
  Heraeus Kulzer

Stains
(Reagents from Grale Scientific)

Goldner’s Trichrome stain

1. Weigert’s iron hemotoxylin (DeGroat)

a) Hemotoxylin solution
Hemotoxylin	1g
Absolute Alcohol	100mL
b) Iron Solution
30% aqueous ferric chloride	4mL
Hydrochloric acid (concentrated)	1mL
distilled Water	95mL

Filtered and added to equal volume of hemotoxylin immediately before stain used.

2. Ponceau-fuchsin-azophloxin stock solutions

a) Ponceau de xylidine solution
Ponceau de xylidine	0.75g
acid fuchsion	0.25g
Acetic Acid	1mL
mix, and add distilled water (100mL)
b) azophloxin solution
Azophloxin	0.5g
Acetic acid	0.6mL
mix, and add distilled water (100mL)
c) Final working stain solution
Ponceau-fuchsin solution	5-10mL
Azophloxin	2mL
0.2% acetic acid solution	88mL

3. Light Green Solution

Light Green	1g
acetic acid	1mL
Mix, and add distilled water (500mL)

4. Phophomolybdic acid-Orange G solution

Phosphomolybdic acid	3g
Orange G	2g
Dissolve in 500mL of distilled water and add crystal thymol.

Von Kossa Stain

1% aqueous silver nitrate

2.5% sodium thiosulfate

1% safranin O

Alcian blue stain

Alcian blue 8GX	1g
3% acetic acid solution	100mL

Hemotoxylin and Eosin stain

a)Harris’s hemotoxylin
Hemotoxylin	2.5g
Absolute alcohol	25mL
Potassium Alum	50g
distilled water	500mL
mercuric oxide	1.25g OR
Sodium iodate	0.5g
Glacial acetic acid	20mL
b) Eosin solution
Commercially produced Eosin was used.

All stain dye powders are Gurr dye powders.
All reagents are analytical reagents, and not Lab reagents

Fluorochromes

Manufacturer	Fluorochrome	Catalogue Number
Sigma-Aldrich, Sydney	Calcein Green	C0875
Sigma-Aldrich, Sydney	Alizarin Complexone	A3882
Intervet Australia, Victoria	Oxytetracycline (off the shelf antimicrobial drug)	Tradename; Engemycin 100