Mismatch repair imagerie et les réponses cellulaires aux dommages de l&#39;ADN dans</em

Résumé

Un protocole détaillé est décrit pour l'imagerie en temps réel la formation de complexes de réparation de l'ADN Cellules.

Résumé

Les deux procaryotes et les eucaryotes répondent aux dommages à l'ADN à travers un ensemble complexe de changements physiologiques. Altérations de l'expression génique, la redistribution des protéines existantes, et l'assemblage des complexes protéiques nouvelle peut être stimulée par une variété de lésions de l'ADN et dépareillés paires de bases d'ADN. La microscopie à fluorescence a été utilisé comme un puissant outil expérimental pour la visualisation et la quantification de ces réponses et autres lésions de l'ADN et à surveiller l'état de réplication de l'ADN au sein de l'architecture complexe subcellulaire d'une cellule vivante. Fusions traductionnelles entre les protéines rapporteur fluorescent et des composants de la réplication de l'ADN et les machines de réparation ont été utilisés pour déterminer les indices que les protéines cibles réparation de l'ADN de leurs lésions apparentées

Protocole

Cultures en croissance de cellules pour la microscopie

1. Un ou deux jours avant l'imagerie, de préparer le B. subtilis souche contenant la protéine de fusion traductionnelle vous souhaitez visualiser. Tours de première instance de 1A et 1B étapes seront nécessaires pour déterminer quelle condition la croissance fournit les meilleures images de vos contraintes. Dans la plupart des cas, les cellules doivent être imagés pendant la phase de croissance exponentielle.

1. Pour certaines B. souches subtilis (en particulier, les souches qui poussent mal en raison de l'intégration de la fusion trad....

Discussion

Essais et erreurs sont nécessaires pour trouver des conditions d'exposition pour des images de haute qualité pour chaque souche; nous trouvons que 1 milliseconde est approprié pour des images en lumière blanche, tandis que des expositions de 100 à 2000 ms sont appropriés pour la GFP (FITC) et FM4-64 (TRITC ) des images. Le temps d'exposition varie en fonction de l'équipement d'imagerie utilisée. Nous recommandons l'utilisation d'une souche par lame de microscope 15 puits pour les plus simples d&#.......

Matériaux

Recettes solution spécifique ^1:

S7 10x ₅₀ sels de
0,5 M MOPS
100 mM de sulfate d'ammonium
50 mM phosphate de potassium monobasique
Stériliser par filtration, et enveloppez-S7 ₅₀ médias dans la feuille avant l'entreposage

Métaux 100x
0,2 M MgCl ₂
70 _mM de CaCl2
5 _mM de MnCl2
0,1 mM _ZnCl2
100 pg / ml de thiamine HCl
2 mM HCl
0,5 mM FeCl ₃ *
dH ₂ O au volume final
* FeCl ₃ devrait être ajouté en dernier, pour empêcher la précipitation.
Après la stérilisation du filtre, la solution de métal envelopper dans du papier 100x.

S7 ₅₀ médias
1x S7 ₅₀ sels de
Métal 1x
1% de glucose
Glutamate 0,1%
40 ug / ml tryptophane
40 ug / ml phénylalanine
H ₂ O distillée au volume final

Spizizens 10x (grammes / L)
151,4 mM de sulfate d'ammonium (20g / L)
803,8 mM Potassium phosphate monobasique (140g / L)
440,9 mM de potassium phosphate dibasique (60g / L)
34,0 mM citrate de sodium (10g / L)
16,6 mM MgSO ₄ (2g / L)
dH ₂ O au volume final
Stériliser par filtration