Beredning av Drosophila polytene Kromosom Squash för Antibody Labeling
Summary
Denna video protokoll illustrerar squash teknik som används i Johansen laboratoriet att förbereda<em> Drosophila</em> Polytene kromosomer för antikroppar märkning.
Abstract
Drosophila har länge varit en favorit modellsystem för att studera sambandet mellan kromatinstrukturen och genreglering på grund av den cytologiska fördelar som den jättelika saliv kromosomer körtel polytene tredje INSTAR larver. I denna vävnad kromosomerna genomgår många rundor av replikering i avsaknad av celldelning som ger upphov till cirka 1000 exemplar. De DNA kvar anpassat efter varje replikationsförmåga cykel resulterar i kraftigt förstorad kromosomer som ger en unik möjlighet att korrelera kromatin morfologi med lokalisering av specifika proteiner. Därför har det funnits en hög nivå av intresse i fastställandet av epigenetiska modifieringar närvarande vid olika gener i olika skeden av transkriptionen. Ett viktigt verktyg för sådana studier är märkning av polytene kromosomer med antikroppar mot enzymet, transkriptionsfaktor, eller histon ändring av intresse. Denna video protokoll illustrerar squash teknik som används i Johansen laboratoriet att förbereda Drosophila polytene kromosomer för antikroppar märkning.
Protocol
Discussion
Införandet av ättiksyra och mjölksyra i konventionella protokoll squash fixering underlättar både interband upplösning och kromosomala armen sprids men tyvärr vissa epitoper inte överlever denna behandling. Ett exempel på en sådan epitop är H3S10ph (CAI et al., 2008). Sedan syrabehandling har också nackdelen att det släcker inneboende fluorescens GFP taggade-proteiner, DiMario et al. (2006) nyligen utvecklat en formaldehydbaserade "syrafritt squash teknik" som möjliggör direkt …
Acknowledgements
Vi tackar Ms V. Lephart för underhåll av fluga lager Detta arbete stöddes av National Institutes for Health bidrag (GM62916) och National Science Foundation (MCB0817107).
References
- Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila. Development. 135, 2917-2925 (2008).
- DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes. Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).
- Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies. Methods. 48, 387-397 (2009).
