Microfluïdische Co-cultuur van epitheliale cellen en bacteriën voor het onderzoeken van Oplosbaar Signal-gemedieerde interacties
Summary
Dit protocol beschrijft een microfluïdisch co-cultuur model voor gelijktijdige en gelokaliseerde cultuur van epitheliale cellen en bacteriën. Dit model kan gebruikt worden voor het onderzoeken van de rol van verschillende oplosbare moleculaire signalen op pathogenese en het scherm van de effectiviteit van de vermeende probiotische bacteriestammen.
Abstract
De menselijke gastro-intestinale (GI) stelsel is een unieke omgeving waarin darmepitheelcellen en niet-pathogene (commensale) bacteriën naast elkaar bestaan. Men heeft voorgesteld dat de micro-omgeving die de pathogeen ontmoetingen in de commensale laag is van belang bij het bepalen van de mate van kolonisatie. Huidige cultuur methoden voor onderzoek pathogeen kolonisatie zijn niet goed geschikt voor het onderzoeken van deze hypothese omdat zij co-cultuur van bacteriën en epitheelcellen niet in staat stellen op een wijze die het maag-darmkanaal micro-omgeving nabootst. Hier beschrijven we een microfluïdisch co-cultuur model dat onafhankelijke cultuur van eukaryote cellen en bacteriën mogelijk maakt, en het testen van het effect van de commensale micro-omgeving op de ziekteverwekker kolonisatie. De co-cultuur model wordt aangetoond door het ontwikkelen van een commensale<em> Escherichia coli</em> Biofilm onder HeLa cellen, gevolgd door de introductie van enterohemorragische<em> E. coli</em> (EHEC) in de commensale eiland, in een volgorde die de volgorde van gebeurtenissen in het maagdarmkanaal infectie nabootst.
Protocol
Discussion
Conventionele testen voor pathogeen bevestiging en kolonisatie gebruik maken van een monolaag van eukaryote cellen in weefselculturen platen waarin ziekteverwekkers worden toegevoegd. Deze modellen zijn fysiologisch niet relevant zijn als ze niet een commensale bacteriële biofilm ontwikkeld op eukaryote cellen te nemen. Eenvoudige toevoeging van een pre-volwassen bacteriecultuur aan eukaryote cellen is onwaarschijnlijk dat leiden tot deze bevestiging als biofilms zijn zeer georganiseerde structuren die zich ontwikkelen…
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door de National Science Foundation (cbet 0.846.453) en de National Institutes of Health (1R01GM089999).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SU-8 2050 | Microchem Corp, MA | |||
| high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask | Fineline-Imaging Inc, CO | |||
| Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 77279 | ||
| PDMS | Dow Corning, WI | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | ||
| DMEM | Thermo Scientific | SH30002.02 | ||
| Programmable spin coater | Laurell Tech Corp | WS0650S | ||
| Mask aligner | Neutronix-Quintel, PA | Q4000 | ||
| Oxygen plasma etcher | March Plasma System, CA | CS-1701 | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus, MA | |||
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 |
References
- McDonald, J. C. Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing. Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).
- Jeon, N. L. Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems. Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).
- Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development. J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).
- Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures. Lab Chip. 6, 623-631 (2006).
- Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA. BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).
- Hsu, C. H., Folch, A. Microfluidic devices with tunable topographies. Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).
- Hui, E. E., Bhatia, S. N. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5722-5726 (2007).
- Lee, J. Y. Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures. Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).
- Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions. Lab-on-Chip. , (2009).
