Microfluidiques Co-culture de cellules épithéliales et des bactéries d'enquête sur les Soluble signal médiée par des interactions
Summary
Ce protocole décrit une microfluidique de co-culture de modèle pour la culture simultanée et localisée des cellules épithéliales et des bactéries. Ce modèle peut être utilisé pour étudier le rôle des différents signaux moléculaires solubles sur la pathogenèse ainsi que l'écran de l'efficacité des souches bactériennes probiotiques putatifs.
Abstract
La gastro-intestinal humain intestinal (GI) est un environnement unique dans lequel les cellules épithéliales intestinales et non pathogènes (commensaux) les bactéries coexistent. Il a été proposé que le microenvironnement des rencontres que l'agent pathogène dans la couche commensale est importante pour déterminer l'ampleur de la colonisation. Les méthodes de culture actuelles pour enquêter sur la colonisation des pathogènes ne sont pas bien adaptés pour enquêter sur cette hypothèse car ils ne permettent pas de co-culture de bactéries et de cellules épithéliales d'une manière qui imite le microenvironnement tractus gastro-intestinal. Nous décrivons ici un microfluidique de co-culture modèle qui permet la culture indépendante des cellules eucaryotes et les bactéries, et de tester l'effet du microenvironnement commensale sur la colonisation d'agents pathogènes. Le modèle de co-culture se manifeste par l'élaboration d'un commensal<em> Escherichia coli</emBiofilm> parmi les cellules HeLa, suivie par l'introduction de entérohémorragique<em> E. coli</em> (EHEC) dans l'île commensaux, dans une séquence qui imite la séquence des événements dans les infections des voies gastro-intestinales.
Protocol
Discussion
Essais classiques pour l'attachement des agents pathogènes et la colonisation d'utiliser une monocouche de cellules eucaryotes dans des plaques de culture de tissu dans lequel des agents pathogènes sont ajoutés. Ces modèles ne sont pas physiologiquement pertinents car ils n'intègrent pas un biofilm bactérien commensal développés sur les cellules eucaryotes. La simple addition d'une culture pré-cultivé des bactéries aux cellules eucaryotes est peu probable d'aboutir à cette conformation qu…
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par la National Science Foundation (EFAC 0.846.453) et le National Institutes of Health (1R01GM089999).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SU-8 2050 | Microchem Corp, MA | |||
| high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask | Fineline-Imaging Inc, CO | |||
| Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 77279 | ||
| PDMS | Dow Corning, WI | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | ||
| DMEM | Thermo Scientific | SH30002.02 | ||
| Programmable spin coater | Laurell Tech Corp | WS0650S | ||
| Mask aligner | Neutronix-Quintel, PA | Q4000 | ||
| Oxygen plasma etcher | March Plasma System, CA | CS-1701 | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus, MA | |||
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 |
References
- McDonald, J. C. Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing. Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).
- Jeon, N. L. Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems. Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).
- Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development. J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).
- Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures. Lab Chip. 6, 623-631 (2006).
- Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA. BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).
- Hsu, C. H., Folch, A. Microfluidic devices with tunable topographies. Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).
- Hui, E. E., Bhatia, S. N. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5722-5726 (2007).
- Lee, J. Y. Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures. Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).
- Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions. Lab-on-Chip. , (2009).
