Mikroflödessystem Co-kultur av epitelceller och bakterier för att utreda Löslig Signal-medierade interaktioner
Summary
Detta protokoll beskriver en mikroflödessystem co-kultur-modellen för samtidig och lokal kultur av epitelceller och bakterier. Denna modell kan användas för att undersöka betydelsen av olika lösliga molekylära signaler på patogenes samt skärm effektiviteten av förmodade probiotiska bakteriestammar.
Abstract
Den mänskliga gastrointestinala (GI) tarmkanalen är en unik miljö där tarmens epitelceller och icke-patogena (kommensala) bakterier samexistera. Det har föreslagits att mikromiljön att patogenen möten i kommensala skiktet är viktigt för att bestämma omfattningen av koloniseringen. Aktuell kultur metoder för att undersöka patogen kolonisation är inte väl lämpade för att undersöka denna hypotes eftersom de inte möjliggöra sam-kultur av bakterier och epitelceller på ett sätt som efterliknar mag-tarmkanalen mikromiljö. Här beskriver vi en mikroflödessystem co-kultur-modell som möjliggör oberoende kultur av eukaryota celler och bakterier, och testa effekten av kommensala mikromiljön på patogen kolonisering. Samarbetet kulturen modell bevisas av att utveckla en commensal<em> Escherichia coli</em> Biofilm bland HeLa celler, följt av införandet av enterohemorragisk<em> E. coli</em> (EHEC) i commensal ön, i en sekvens som härmar händelseförloppet i mag-tarmkanalen infektion.
Protocol
Discussion
Konventionella analyser för patogen kvarstad och kolonisering använda ett monolager av eukaryota celler i form av plattor vävnadsodling där patogener läggs till. Dessa modeller är inte fysiologiskt relevanta eftersom de inte innehåller en kommensala bakteriell biofilm utvecklas på eukaryota celler. Enkel tillägg av en pre-vuxen bakteriekultur att eukaryota celler är osannolik att leda till denna struktur som biofilmer är mycket välorganiserade strukturer som utvecklas över tiden, och det är oerhört svårt…
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av National Science Foundation (CBET 0.846.453) och National Institutes of Health (1R01GM089999).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SU-8 2050 | Microchem Corp, MA | |||
| high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask | Fineline-Imaging Inc, CO | |||
| Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 77279 | ||
| PDMS | Dow Corning, WI | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | ||
| DMEM | Thermo Scientific | SH30002.02 | ||
| Programmable spin coater | Laurell Tech Corp | WS0650S | ||
| Mask aligner | Neutronix-Quintel, PA | Q4000 | ||
| Oxygen plasma etcher | March Plasma System, CA | CS-1701 | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus, MA | |||
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 |
References
- McDonald, J. C. Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing. Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).
- Jeon, N. L. Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems. Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).
- Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development. J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).
- Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures. Lab Chip. 6, 623-631 (2006).
- Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA. BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).
- Hsu, C. H., Folch, A. Microfluidic devices with tunable topographies. Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).
- Hui, E. E., Bhatia, S. N. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5722-5726 (2007).
- Lee, J. Y. Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures. Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).
- Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions. Lab-on-Chip. , (2009).
