Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg
Summary
Den här videon demonstrerar en metod att dissekera och kultur commissural nervceller från E13 råtta rygg ryggmärgen. Dissocierade commissural nervceller är användbara för att studera de cellulära och molekylära mekanismer av axon tillväxt och vägledning.
Abstract
Commissural nervceller har ofta använts för att undersöka mekanismerna bakom axonet vägledning under embryonal ryggmärgen utveckling. Cellen organ i dessa nervceller är belägna i rygg ryggmärgen och deras axoner följa stereotypa banor under fosterutvecklingen. Commissural axoner ursprungliga projektet ventralt mot floorplate. Efter att ha korsat mittlinjen, dessa axoner tur anteriorly och projekt mot hjärnan. Vart och ett av dessa steg är reglerad genom inverkan av flera vägledning signaler. Kulturer höganrikat i commissural nervceller är idealiska för många experiment behandlar mekanismer axonet pathfinding, inklusive vrida analyser, immunkemi och biokemi. Här beskriver vi en metod för att dissekera och kultur commissural nervceller från E13 råtta rygg ryggmärgen. För det första är ryggmärgen isolerade och rygg strips är dissekeras ut. Den dorsala vävnaden är då särskiljas i en cell avstängning av trypsinization och mekaniska störningar. Nervceller är klädd på poly-L-lysin-belagda glas täckglas eller vävnad-kultur rätter. Efter 30 timmar<em> In vitro</em> Har de flesta nervceller förlängd ett axon. Renheten av kulturen (Yam<em> Et al.</em> 2009), vanligtvis över 90%, kan bedömas genom immunolabeling med commissural neuron markörer DCC, LH2 och TAG1 (Helms och Johnson, 1998). Detta neuronala preparat är ett användbart verktyg för<em> In vitro</em> Studier av cellulära och molekylära mekanismer av commissural axon tillväxt och vägledning under ryggmärgen utveckling.
Protocol
Discussion
Vi har beskrivit en metod för att dissekera och kultur commissural nervceller från embryonala råtta ryggmärgen. Detta förfarande har använts rutinmässigt i våra labb på ett tillförlitligt sätt förbereda nervceller för att studera de cellulära och molekylära mekanismer av Axon vägledning. För cellbiologi och experiment immunkemi, dissektion av en kull producerar tillräckligt med nervceller. När fler celler behövs, kan till exempel i många biokemi experiment, dissekering av två kullar krävas. För e…
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag från den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR), Peter Lougheed Medical Research Foundation, McGill Program i Neuroengineering, de Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) och Kanada Stiftelsen för innovation (CFI ). Sébastien D. Langlois stöddes av en Master Training Award från Fonds de la recherche en Santé du Québec (FRSQ) och av en Frederick Banting och Charles Best Kanada Graduate Stipendier Master Award från den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR). Vi är tacksamma för att Jessica MT Pham för hjälp med siffror.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium, liquid | Invitrogen | 21103-049 | See Recipes and Comments | |
| B27 supplement 50X | Invitrogen | 17504 | See Recipes and Comments | |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma | P4707 | ||
| L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-070 | ||
| Trypsin 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090-046 | ||
| DNAse I, 25000 U/mL | Worthington | |||
| MgSO4 | Sigma | M2643 | ||
| HBSS, Ca2+/Mg2+-free | Invitrogen | 14170-112 | ||
| L-glutamine 200mM, liquid | Invitrogen | 25030-081 | See Recipes and Comments |
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I)
- E13 pregnancy-staged rat
- Ethanol 70%
- Surgical scissors, Fine Science Tools
- Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools
- Petri dishes
- L-15 medium
- Dissection microscope, Leica
- Plastic transfer pipettes
- Microscissors, Fine Science Tools
- Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools
- Heat-inactivated Horse Serum (HiHS)
- 15 ml plastic tubes
Commissural neuron culture (see also Table I)
- Tissue culture incubators (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
- German Desag glass coverslips and/or plastic tissue culture dishes
- Poly-L-lysine, Sigma
- Sterile milliQ H2O
- Neurobasal, Invitrogen
- Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HiFBS)
- L-Glutamine
- B27, Invitrogen
- Penicillin/Streptomycin antibiotics
- 37°C waterbath
- Sterile Pasteur Pipettes
- Bunsen gas burner
- HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen
- DNAse, Worthington
- MgSO4
- Centrifuge
- Hemacytometer
- Trypan Blue Solution
References
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc. Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).
- Helms, A. W., Johnson, J. E. Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression. Development. 125, 919-928 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
- Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons. Nature. 444, 369-373 (2006).
- Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway. Neuron. 62, 349-362 (2009).
