ראשי תאים אנושיים אפיתל הסימפונות גדלה מ Explants
Summary
כאן אנו מתארים את שיטת מפורט לגידול העיקרי בתאים אנושיים אפיתל הסימפונות מ explants של רקמה אנושית דרכי הנשימה הסימפונות כולל גידול הבדיל על ממשק אוויר נוזלי. שיטה זו מספקת מקור שופע של תאים ראשוניים על חקירת תפקידו של אפיתל דרכי הנשימה בריאות מחלת ריאות האדם.
Abstract
האדם תאים אפיתל הסימפונות יש צורך מודלים התא של המחלה כדי לחקור את ההשפעה של excipients וסוכני תרופתי על תפקוד ומבנה של תאים אפיתל אנושיים. כאן אנו לתאר בפירוט את השיטה של גידול בתאי אפיתל הסימפונות מרקמות דרכי הנשימה הסימפונות כי הוא שנקטפו על ידי המנתח על פי ניתוחים הריאות (סרטן ריאות למשל או ניתוח הקטנת נפח הריאה). באישור אתיקה הסכמה מדעת, המנתח לוקח את מה שדרוש על פתולוגיה מספק לנו חלק הסימפונות כי הוא מרוחק מאזורי החולות. הרקמה משמשת אז כמקור explants כי ניתן להשתמש לגידול העיקרי לתאי האפיתל הסימפונות בתרבות. קטעי הסימפונות על 0.5-1cm ארוך ≤ 1cm בקוטר הם שטופים עם EBSS קר רקמות parenchymal עודף מוסר. מגזרי נחתכים פתוח טחון לתוך 2-3mm<sup> 3</sup> פיסות רקמה. חתיכות משמשים כמקור של תאים ראשוניים. לאחר 100mm ציפוי צלחות תרבות שעות 1-2 עם שילוב של קולגן (30 מיקרוגרם / מ"ל), פיברונקטין (10 מיקרוגרם / מ"ל), ו – BSA (10 מיקרוגרם / מ"ל), צלחות הם שרוטים באזורים 4-5 ורקמות חתיכות ממוקמים באזורים שרוט, אז בינוני תרבות (DMEM / חם ה-F-12 עם תוספים) מתאים צמיחת תאים אפיתל מתווסף וצלחות ממוקמים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס CO 5%<sub> 2</sub> האוויר humidified. בינוני התרבות משתנה כל 3-4 ימים. לתאי האפיתל לצמוח מן החלקים ויוצרים כ -1.5 ס"מ קוטר הטבעות 3-4 שבועות. Explants ניתן שימוש חוזר עד 6 פעמים על ידי העברת אותם מראש מצופה צלחות חדשות. תאים הם הרימו באמצעות טריפסין / EDTA, ונקווה, נספר, מחדש מצופה ב T75 צלוחיות Bind Cell להגדיל את מספרם. T75 seeded צלוחיות עם 2-3 מיליון תאים לגדול מפגש 80% ב 4 שבועות. מורחבות תאים ראשוניים אפיתל האדם יכול להיות תרבותי מותר להבדיל על ממשק אוויר נוזלי. השיטות המתוארות כאן לספק מקור שופע של האדם תאים אפיתל הסימפונות מרקמות מבודדים טרי ולאפשר לחקר התאים הללו כמודלים של המחלה ועל פרמקולוגיה סינון הרעלים.
Protocol
Discussion
במחקר זה הצגנו שיטות מפורטות תרבות והרחבה של האדם תאים ראשוניים אפיתל הסימפונות. הראינו כיצד explants והשתלות של רקמת הסימפונות, תרבותי בתקשורת אשר לקדם גדילת תאים אפיתל, יכולים לספק מקור מתמיד של תאים אפיתל דרכי הנשימה האנושית ללימודי הלא מובחן מודלים תא (שקוע) הבדיל (ג?…
Acknowledgements
המחברים מודים מאוד ד"ר ריצ'רד Inculet למתן הרקמות הסימפונות. מחקר אתיקה האישורים מועצת התקבלו המילטון בריאות סנט ג'וזף של אוניברסיטת מערב אונטריו / לונדון למדעי הבריאות מרכז (ד"ר דוד מקורמק), רקמות ארכיון הוועדה, המחלקה לפתולוגיה. אנו מודים גם ארני שפיצר (מיקרוסקופית אלקטרונים, אוניברסיטת מקמאסטר) למתן TEMs של תרבויות עלי שלנו, פרקש דניאלה למתן חלק מהחומרים הדרושים immunostaining. עבודה זו מומנה על ידי מענק בלוק טווח מהחברה אונטריו בית החזה, ד"ר אסמא יגי נתמכה על ידי מלגה FSORC, בריאות סנט ג'וזף, המילטון, אונטריו, קנדה.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma | A4919 | Use for coating solution | |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma | C8919 | Use for coating solution | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma | F2006 | Use for coating solution | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution | |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma | D8437 | ||
| FBS | Sigma | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | BSA | |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma | P1476 | BPE | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | EGF | |
| (±)-Epinephrine | Sigma | E1635 | ||
| Insulin | Sigma | I6634 | ||
| Tranferrin Human | Sigma | T8158 | ||
| Triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | ||
| Hydorcortisone | Sigma | H0888 | ||
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | ||
| Trypsin | Sigma | T9935 | ||
| EDTA | Sigma | E6758 | EDTA | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P5368 | PBS | |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | |||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | ||
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth | |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution | |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma- Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution | |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody | |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma- Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa-Cruz | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody | |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa-Cruz | Use 1:100 dilution | ||
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence during prolonged storage | |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage | |
| Hoechst Stain solution | Sigma | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers.
References
- Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts – Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. , (2008).
- Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 283, L791-L798 (2002).
- Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium. In Vitro. 18, 633-642 (1982).
- Yoshisue, H. Characterization of ciliated bronchial epithelium 1, a ciliated cell-associated gene induced during mucociliary differentiation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 491-500 (2004).
- Wetering, S. v. a. n. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).
- Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).
- Mattinger, C., Nyugen, T., Schafer, D., Hormann, K. Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells. Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 235-238 (2002).
- Freshney, R. I., Freshney, R. I. . Culture of epithelial cells. , 1-23 (1992).
- Freshney, R. I., Freshney, R. I. Normal human bronchial epithelial cell cultures in Culture of specialized cells series. Culture of epithelial cells. , 181-196 (1992).
